免疫印跡（western blotting，WB)實驗服務項目

免疫印跡（western blotting，WB)是一種結合了SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫測定的高特異性和敏感性來檢測蛋白的方法。其采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，然后再以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

免疫印跡的流程：

1. 蛋白質(zhì)的抽提

2. 蛋白質(zhì)定量

3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE）

4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜

5. 膜的封閉和一抗抗體孵育

6. HRP標記二抗孵育

7. 加入ECL發(fā)光劑，暗室曝光，膠片顯影

蛋白樣品制備

做 WB 之前，蛋白質(zhì)的提取至關重要，成也提取敗也提取。

相關步驟如下：

一、單層貼壁細胞總蛋白的提取

1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。詳細信息>>

SDS－PAGE 電泳

電泳開始，相關步驟如下：

一、清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。詳細信息>>

轉(zhuǎn)膜

相關步驟如下：

1. 轉(zhuǎn)一張膜需準備 6 張 7.0～8.3 cm 的濾紙和 1 張 7.3～8.6 cm 的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸 2 h 才可使用。

要領：（1）用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里。詳細信息>>

封閉及一抗二抗孵育

在做雜交時，個人建議：還是使用雜交袋進行一抗和二抗的孵育，這樣節(jié)約抗體。

相關步驟如下：

1. 將膜用 TTBS 從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h。必要時可先用麗春紅染色（2 %乙酸、0.5 %麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和 TTBS 將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白 marker 則可省略此步。詳細信息>>

暗室膠片曝光

若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強發(fā)光強度：

1．用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進行曝光，可延長曝光時間；2．將膜在 PBST 或 TTBS 中洗滌 30 min 或更長，期間至少換 2 次液。詳細信息>>

western blotting(WB)服務須知：

1. 樣本要求盡可能新鮮；

2. 樣本量：組織樣本，質(zhì)量大于100mg；細胞樣本，細胞數(shù)大于1×106；

3. 您可自備一抗，也可讓我公司代買。為保證質(zhì)量，抗體為進口單克隆抗體；

4. 服務時限和內(nèi)容：收到樣本之日起20-30個工作日內(nèi)提交實驗結果，具體包括實驗方法、步驟、所用試劑、儀器、圖片及相關分析數(shù)據(jù)等；

5. 報告提供：實驗結果將以電子或書面形式提交給您。