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初級(jí)會(huì)員 | 第8年
PCR實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)失敗結(jié)果探究2025/03/11
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件,應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng),體外程序化地特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。PCR的最大特點(diǎn),是能將微量的DNA大幅增加。一、模板質(zhì)量問題:1)模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低??梢耘軅€(gè)電泳看看提取的DNA,PCR陽性樣品與陰性樣品是否有明顯差別。如果確定是這種問題,可以增加模板量試試,但不一定行得通。2)模板里面殘留某種試劑成份,可能抑制Taq聚合酶的活性,如果是這種情況,可以用試劑盒
化學(xué)試劑穩(wěn)定性判斷遵循原則2025/03/04
化學(xué)試劑(chemicalreagent)是進(jìn)行化學(xué)研究、成分分析的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),是科技進(jìn)步的重要條件,廣泛用于物質(zhì)的合成、分離、定性和定量分析,可以說是化學(xué)工作者的眼睛,在工廠、學(xué)校、醫(yī)院和研究所的日常工作中,都離不開化學(xué)試劑。判斷化學(xué)試劑的穩(wěn)定性,可遵循以下幾個(gè)原則:1、無機(jī)化合物,只要妥善保管,包裝完好無損,可以長(zhǎng)期使用。但是,那些容易氧化、容易潮解的物質(zhì),在避光、蔭涼、干燥的條件下,只能短時(shí)間(1~5年)內(nèi)保存,具體要看包裝和儲(chǔ)存條件是否合乎規(guī)定。2、有機(jī)小分子量化合物一般揮發(fā)性較強(qiáng),包
血清、血漿及全血的用途作用2025/02/25
血液生化指標(biāo)的分析及激素等含量的測(cè)定對(duì)臨床判斷、預(yù)測(cè)藥物毒性作用及疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要的意義。那么,血清、血漿、全血有何區(qū)別,各自的用途是什么呢?1、常見的血液生化指標(biāo)與激素常見的血液生化指標(biāo):血糖(GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(Crc)、尿素氮(BUN)、膽固醇(CHO)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、鎂、鈣等。常見的激素:睪酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、游離三碘甲
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)影響因素介紹2025/02/18
PCR(PolymeraseChainReaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是,首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈,DNA樣品中,特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交,在dNTPs和Taq酶存在時(shí),就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈,反應(yīng)完成后,將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性,溫度下降后,過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次,使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。1.變性:加熱使模板DNA在高溫下(94℃)變性,
PCR產(chǎn)物常用的直接純化技術(shù)方法2025/02/14
PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、TaqDNA酶及dNTP,這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的酶切、雙脫氧PCR測(cè)序反應(yīng)等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用化試劑盒的出現(xiàn)使得DNA的純化過程變得更加簡(jiǎn)便快捷。PCR擴(kuò)增完成后需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在條帶單一無其他雜帶的情況下,可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化,常見的純化方法有:一、產(chǎn)物直接純化:1、硅膠層析柱法原理:大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜,實(shí)際上就是一層玻璃纖維,其表面有大量修飾的硅羥基(Si-OH),硅羥基在溶液中解離
ELISA實(shí)驗(yàn)是否需重做判斷指南2025/02/06
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。在檢測(cè)時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗原)與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體,通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。ELISA實(shí)驗(yàn)過程中時(shí)常發(fā)生重做的情況,實(shí)驗(yàn)是否需要重新進(jìn)行,判斷可以根據(jù)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限、對(duì)照反
關(guān)于蛋白質(zhì)沉淀鹽析方法探究2025/01/21
蛋白質(zhì)通過鹽析的辦法沉淀的原理是降低蛋白質(zhì)的溶解度,使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出。蛋白質(zhì)的沉淀(proteinprecipitation),沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象,稱為蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)沉淀常用的方法有鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、生物堿試劑與某些酸沉淀等。在生化制備中,沉淀主要用于濃縮目的,或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制備中常用的鹽析法多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。一般來說,所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法原理簡(jiǎn)述2025/01/14
目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)方法分為染料法和探針法,染料法以SYBRGreen法為代表,SYBRGreen染料游離時(shí)熒光微弱,但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后,熒光大大增強(qiáng),反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系,因此可以通過檢測(cè)熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA(PCR產(chǎn)物)的量,但該方法沒有特異性,非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。對(duì)于探針法來說,反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物量的依據(jù)。但其發(fā)光機(jī)制卻與染料法全不同。根據(jù)所使用的技
微生物培養(yǎng)基配置指南2025/01/07
培養(yǎng)基(culturemedium)是人工配制的,適合微生物生長(zhǎng)、分離鑒別的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。一般基礎(chǔ)培養(yǎng)基中古有蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化鈉、瓊脂等基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。微生物培養(yǎng)基應(yīng)用范圍很廣。例如,無菌試驗(yàn)培養(yǎng)基可檢查藥品、生物制品是否污染細(xì)菌,它直接關(guān)系到人民用藥安全;在臨床及食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中常用選擇、鑒別培養(yǎng)基,此類培養(yǎng)基中根據(jù)用途不同,需要加入抑菌劑、指示劑、血液、糖等試劑,以利于特定細(xì)菌的分離與鑒別,需要使細(xì)菌大量生長(zhǎng)、繁殖的各類培養(yǎng)基;病毒培養(yǎng)及疫苗中則需用組織細(xì)胞培養(yǎng)液,主要成分為多種氨基
抗體的作用功能及局限性介紹2024/12/24
抗體是一種被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等的大型Y形蛋白質(zhì),是一種免疫球蛋白。它的產(chǎn)生是由于抗原侵入人體后引起各種免疫細(xì)胞相互作用,使淋巴細(xì)胞中的B細(xì)胞增殖分化而形成漿細(xì)胞(效應(yīng)B細(xì)胞),漿細(xì)胞可產(chǎn)生分泌抗體。抗體的分類:按作用對(duì)象,可將其分為抗毒素、抗菌抗體、抗病毒抗體和親細(xì)胞抗體??贵w的作用機(jī)理:(1)、抗體在抗原顆粒和吞噬細(xì)胞之間“搭橋”,從而加強(qiáng)了吞噬細(xì)胞的吞噬作用。(2)、抗體與相應(yīng)顆粒性抗原結(jié)合后,改變抗原表面電荷,降低吞噬細(xì)胞與抗原之間的靜電斥力。(3)、抗體可中和某
ELISA酶標(biāo)儀的檢測(cè)單位和檢測(cè)值計(jì)算2024/12/17
ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法簡(jiǎn)稱酶標(biāo)法,是標(biāo)記技術(shù)中的一種,是從熒光抗體技術(shù),同位素免疫技術(shù)發(fā)展而來的一種敏感,特異,快速并且能自動(dòng)化的現(xiàn)代技術(shù)。酶標(biāo)法的基本原理是將抗原或抗體與酶用膠聯(lián)劑結(jié)合為酶標(biāo)抗原或抗體,此酶標(biāo)抗原或抗體可與固相載體上或組織內(nèi)相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生特異反應(yīng),并牢固地結(jié)合形成仍保持活性的免疫復(fù)合物。當(dāng)加入相應(yīng)底物時(shí),底物被酶催化而呈現(xiàn)出相應(yīng)反應(yīng)顏色。顏色深淺與相應(yīng)抗原或抗體含量成正比。由于此技術(shù)是建立在抗原-抗體反應(yīng)和酶的高效催化作用的基礎(chǔ)上,因此,具有高度的靈敏性和特異性,是
活性氧 (ROS) 含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)詳細(xì)說明2024/12/09
活性氧含量檢測(cè)試劑盒通過使用特異性探針或底物與ROS發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ROS含量的測(cè)定。這種檢測(cè)方法基于探針或底物與ROS的特異性反應(yīng),通常使用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)量?;钚匝鹾繖z測(cè)試劑盒具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì):1.高選擇性:活性氧含量檢測(cè)試劑盒能夠特異性地檢測(cè)ROS,避免了其他化學(xué)物質(zhì)的干擾,確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.高靈敏度:活性氧含量檢測(cè)試劑盒能夠檢測(cè)到極低濃度的ROS,使研究人員能夠?qū)OS含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量,揭示微小變化對(duì)細(xì)胞功能和疾病發(fā)展的影響。3.快速和簡(jiǎn)便:活性氧含量檢
PCR基因擴(kuò)增儀應(yīng)用詳細(xì)說明2024/12/03
一、原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增,加熱使雙鏈DNA解開螺旋,在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交,在TaqDNA聚合酶,dNTPs,Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物,重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25~40個(gè)循環(huán),呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。二、分類1.普通的PCR儀一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀,又叫傳統(tǒng)的PCR儀。用途:主要是做一些簡(jiǎn)單的、對(duì)單一退火溫度的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。(1)梯度PCR儀:一次PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)實(shí)驗(yàn)各封閉劑優(yōu)缺點(diǎn)2024/11/25
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay,ELISA)是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理,對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法。封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙,封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,從而排斥在ELISA試劑盒其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。在免疫學(xué)實(shí)
PCR實(shí)驗(yàn)DNA復(fù)制酶系作用順序2024/11/18
DNA的半保留復(fù)制:DNA復(fù)制時(shí),以親代DNA的兩條鏈分別作為模板,在DNA聚合酶的催化下,按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈,組成新的DNA分子,新形成的兩個(gè)子代DNA與親代DNA的堿基順序全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代,而另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?,因此這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。DNA的復(fù)制過程:DNA復(fù)制酶系作用順序:1.拓?fù)洚悩?gòu)酶使DNA超螺旋結(jié)構(gòu)解開,形成其基本的雙螺旋結(jié)構(gòu)。2.解鏈酶使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開,堿基
PCR血液標(biāo)本保存方法及注意事項(xiàng)2024/11/13
最好是用淋巴細(xì)胞分離液把單個(gè)核細(xì)胞分離出來,然后-80℃保存。外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)的分離是免疫學(xué)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)。目前國內(nèi)外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation),用此方法分離PBMC純度可達(dá)95%,淋巴細(xì)胞約占90%,其中T淋巴細(xì)胞占80%,B淋巴細(xì)胞占4~10%。ficoll-hypaque混合溶液,又稱淋巴細(xì)胞分
培養(yǎng)基的配置基本原則匯集2024/10/28
培養(yǎng)基是指供給微生物、植物或動(dòng)物(或組織)生長(zhǎng)繁殖的,由不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組合配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽(包括微量元素)、維生素和水等幾大類物質(zhì)。培養(yǎng)基既是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì),也是細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的配置基本原則:1、選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)總體而言,所有微生物生長(zhǎng)繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水及能源,但由于微生物營(yíng)養(yǎng)類型復(fù)雜,不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求是不一樣的,因此首先要根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需求配制針對(duì)性強(qiáng)的培養(yǎng)基。自
?免疫PCR實(shí)驗(yàn)主要程序及步驟2024/10/21
PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種分子生物學(xué)技術(shù),現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于臨床和實(shí)驗(yàn)室,用于擴(kuò)增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件,最終完成特定基因的體外復(fù)制。主要程序:(1)抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物;(2)加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物;(3)加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA;(4)PCR擴(kuò)增生物素化DNA部分。實(shí)驗(yàn)步驟:(1)制備生物素化DNA將噬粒BLuescriptskt,用生物素標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PC
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR)原理及熒光技術(shù)方法2024/10/14
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)是一種用于實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)特定DNA或RNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針,當(dāng)與擴(kuò)增的DNA或RNA分子結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出信號(hào),從而可以對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測(cè)等應(yīng)用。RT-qPCR原理的三個(gè)主要步驟:1、反轉(zhuǎn)錄:1)、使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。2)、該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。3)、反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。2、PCR擴(kuò)增:1)、使用特定引物對(duì)
影響培養(yǎng)基滅菌效果因素有什么?2024/10/08
滅菌的方法很多,在實(shí)驗(yàn)室可以使用干熱滅菌、對(duì)于環(huán)境可以使用化學(xué)試劑滅菌,但化學(xué)試劑的滅菌方法有很大的限制。在工業(yè)生產(chǎn)中,對(duì)于培養(yǎng)基、管道、設(shè)備的滅菌,通常采用蒸汽加熱到一定的溫度,并保溫一段時(shí)間的滅菌方法,稱之為濕熱滅菌。濕熱滅菌的顯著優(yōu)點(diǎn)是:使用方便,無污染,而且其冷凝水可以直接冷凝在培養(yǎng)基中,也可以通過管道排出。培養(yǎng)基滅菌的效果,影響因素很多,除了培養(yǎng)基內(nèi)雜菌的種類和數(shù)量,滅菌溫度的高低,時(shí)間長(zhǎng)短外,還取決于:1.營(yíng)養(yǎng)成分的保持濕熱滅菌時(shí),微生物被殺死的同時(shí),培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分也遭到了一定的破
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