Uracil DNA Glycosylase, Heat-Labile高效預防PCR氣溶膠污染

——酶活高效，活性可控

操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結果假陽性zui常見的因素。美國科學家Lindahl早在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶），利用UDG酶選擇性水解含dU的DNA單鏈或DNA雙鏈的機制，巧妙地引入dUTP取代PCR體系中的dTTP而構成了dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)。穩(wěn)定使用該系統(tǒng)， 可有效消除PCR體系中混入的擴增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在），保證擴增結果的準確性。

作用原理

dUTP/UDG酶是作為PCR反應體系的配制成分發(fā)揮防污染作用的。作用原理是dUTP使得每個擴增反應生成的PCR產物成為含有dU的DNA鏈。為防止此前積累的殘留產物作為模板干擾擴增反應，在新擴增反應體系進行時，一定溫度下，UDG酶選擇性的催化水解dU-DNA鏈中的尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架的N-糖苷鍵，釋放出游離的尿嘧啶，形成有缺失堿基的DNA鏈。經95℃高溫進一步水解斷裂，從而消除污染。同時高溫使得UDG酶失去活性，不會水解新的dU-DNA鏈（見圖1）。

天然的、未經修飾的DNA不含dU，不受UDG酶影響，繼續(xù)作為PCR/qPCR擴增的模板進行擴增。

圖1. dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)去除殘留擴增污染物示意圖

產品特性

Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile是來源于嗜冷海洋細菌，經大腸桿菌表達純化的重組蛋白，在25-37℃發(fā)揮活性，熱敏感，50℃ 10 min或95℃ 2 min即發(fā)生不可逆滅活。可與熱啟動Taq酶搭配使用，保證擴增的特異性。

①10 U本品經E.coli 16S rDNA特異性的TaqMan qPCR檢測，E.coli基因組殘留低于10拷貝。

②無核酸內外切酶和RNase殘留。

③尿嘧啶是此酶識別的唯—堿基。

dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)使用方法（僅供參考）

1. 根據(jù)實驗需要，dUTP終濃度可在0.2-0.6 mM 之間調整，并選擇性摻入0.2 mM dTTP。

2. 體系中添加UDG酶，添加量1 個單位足矣。1單位可以30min內消化1μg dU-DNA。

3. PCR反應程序前加上25℃-37℃ 2-10min的保溫步驟活化UDG酶活性。

4. 正常進行后續(xù)PCR程序。

效果展示

圖2. 0.05U、0.025U、0.0125U、0.00625U、0.003125U 熱敏UDG酶與360ng 200bp dU-DNA在25℃孵育30min（95℃ 2min滅活）。電泳檢測熱敏UDG酶的降解效果，可以看出0.025U的熱敏UDG就可*消化dU-DNA。

應用場景

氣溶膠是由固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系，在氣體與液體面摩擦時（如在渦旋振蕩后未離心直接開蓋，移液槍反復吹吸樣品、PCR結束后開蓋等）易形成。在分子實驗室中，因頻繁進行上述操作，并長期進行某些特定基因的擴增易出現(xiàn)氣溶膠污染。

PCR是一種指數(shù)擴增微量基因片段的核酸檢測技術，靈敏度*。PCR反應體系中極微量的污染物即可引起假陽性結果。因反應成分多樣，若體系中存在氣溶膠污染物，假陽性的原因不易排查，也很難解決。

dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)可zui大程度的保證PCR、qPCR、RT-qPCR、RPA等核酸檢測結果的準確性。

除此之外，該系統(tǒng)還可用于定點突變克隆、二代測序文庫構建等實驗。

FAQ

Q1: UDG酶可以用于已存在的擴增產物氣溶膠污染嗎？
A: 已存在的擴增產物氣溶膠污染不含dU，此時UDG酶不能發(fā)揮作用。建議選取其他擴增區(qū)域，重新設計引物，并建立dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)，即可避免“未來”的氣溶膠污染。

Q2: dUTP會影響擴增產物的dU-DNA在雜交、測序、克隆和酶切等方面的下游應用嗎？

A：含dU的PCR產物可正常進行核酸雜交和測序，效果與常規(guī)PCR產物無差別。在分子克隆實驗中，連接產物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細胞進行轉化和質粒擴增。酶切實驗中，已證實EcoRI和BamHI不受dU影響，但HindIII酶切效率有所降低，更多內切酶效果還需自行嘗試。

Q3: 含dU的PCR產物后續(xù)做了連接和轉化，無克隆，這是什么原因？

A: 需要特別注意在分子克隆實驗中，連接產物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細胞進行轉化和后續(xù)的質粒擴增。

Q4: UDG酶用于RT-qPCR或RT-PCR體系時，會干擾逆轉錄實驗嗎？
A: 可選用耐受性能良好的逆轉錄酶，如Hifair III Reverse Transcriptase  *作用溫度50-55℃，此時熱敏UDG酶活性極低。

Q5: UDG酶會切割RNA嗎？

A: 不會。在生物體內，UDG酶在DNA修復過程中發(fā)揮重要作用。它可以修復dC脫氨基形成dU的突變，進而避免GC堿基對突變?yōu)锳T堿基對的可能。

Q6: UDG酶反應Buffer是什么？

A:UDG酶可以在各類緩沖液中發(fā)揮作用，如常規(guī)的Taq酶Buffer、連接酶Buffer、酶切Buffer等。

Q7: UDG酶對DNA鏈的堿基個數(shù)有要求嗎？

A: 不能從6堿基或更少的寡核苷酸上水解尿嘧啶。

產品訂購

注：上述產品庫存長期均保留有多個批次以備測試。

注：上述產品庫存充足，該類產品已有多家IVD企業(yè)購買用于生產用途。

HB200331