過度的脂質(zhì)過氧化通過產(chǎn)生有毒的磷脂氫過氧化物（PLOOH），在促進(jìn)鐵死亡中起著重要作用。因此，脂質(zhì)過氧化相關(guān)的生物標(biāo)志物是鐵死亡的關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)。

1.1 脂質(zhì)過氧化物檢測(cè)

BODIPY 581/591 C11 是一種脂溶性比率型熒光探針，能夠嵌入細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)相互作用。在未氧化狀態(tài)下，呈現(xiàn)紅色熒光 (還原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)，亞鐵離子 (Fe2+) 和 ROS 促進(jìn)脂質(zhì)氧化，形成脂質(zhì)過氧化物，BODIPY 581/591 C11 被氧化，發(fā)射波長從 591 nm 轉(zhuǎn)移到 510 nm，產(chǎn)生綠色熒光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。

需要注意的是，BODIPY 581/591 C11 對(duì)脂溶性膜內(nèi)各種活性氧 (ROS) 和過氧亞硝酸鹽 (ONOO-) 也較為敏感，因此它也可以用于鐵死亡細(xì)胞中 ROS 和 RNS 的檢測(cè)。

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BODIPY 581/591 C11 染色參考

1. 儲(chǔ)備液及工作液的制備:

 (1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 儲(chǔ)備液（-20°C 或 -80°C 避光保存，避免反復(fù)凍融）。

 (2) 染色前用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲(chǔ)備液，制備 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液

 （請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度）。

2. 細(xì)胞染色：

 (1) 細(xì)胞制備

 懸浮細(xì)胞：4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。

 貼壁細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶解離細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。

 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。

 (2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室溫孵育 30 分鐘。

 (3) 4°C, 400 ×g 離心 3-4 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。

 (4) 用 1 mL 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2 活性氧的檢測(cè)[20]

活性氧（ROS） 在鐵死亡過程中不僅促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞損傷，還抑制抗氧化信號(hào)通路，是鐵死亡檢測(cè)的重要生物標(biāo)志物。H2DCFDA（DCFH-DA）是一種可滲透細(xì)胞的活性氧探針。進(jìn)入細(xì)胞后，H2DCFDA 在細(xì)胞內(nèi)脫酯化，并被 ROS 氧化成具有強(qiáng)烈熒光的 DCF，產(chǎn)生綠色熒光（Ex: 488 nm, Em: 525 nm）。通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或分光光度計(jì)等設(shè)備可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。

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H2DCFDA 染色方法參考

1. 儲(chǔ)備液及工作液的制備 :

 (1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA儲(chǔ)備液（-20°C或 -80°C避光保存，避免反復(fù)凍融）。

 (2) 染色前用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲(chǔ)備液，配制成1-10μM的H2DCFDA工作液。

 （請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度）。

2. 細(xì)胞染色：

 (1) 懸浮細(xì)胞

 · 離心收集細(xì)胞，保持密度約為1×106

 個(gè)。PBS洗滌兩次，每次5分鐘。

 · 加入1mL 染料工作液，室溫孵育5-30分鐘。

 · 400×g離心3-4分鐘，棄上清。PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次5分鐘。

 · 用1mL無血清培養(yǎng)基或PBS重懸細(xì)胞，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察。

 (2) 貼壁細(xì)胞

 · 將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。

 · 從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，置于載玻片上，吸除多余培養(yǎng)基。加入 100 μL 染料工作液，

 輕輕晃動(dòng)使其完-全覆蓋細(xì)胞，孵育 5-30 分鐘。

 · 吸去染料工作液，培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘，使用熒光顯微鏡觀察。

注：若需要用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，需將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸后再進(jìn)行染色。

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1.3 過氧化脂質(zhì)衍生物的檢測(cè)[21][22]

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中，大量的脂質(zhì)過氧化初級(jí)產(chǎn)物在氧化反應(yīng)中逐漸分解為一系列復(fù)雜的醛類化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。這些活性醛類物質(zhì)能夠攻擊蛋白質(zhì)等生物大分子，形成加合物，從而引發(fā)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。

Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一種基于硫代巴比-妥酸 (TBA) 反應(yīng)物法的試劑盒，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA 與 TBA 在高溫和酸性條件下反應(yīng)，形成一種具有特定顏色的 MDA-TBA 復(fù)合物，其最大吸收波長通常在 532 nm 處，可通過比色法來定量檢測(cè)脂質(zhì)過氧化水平。

此外，4-HNE 抗體可以用來定量檢測(cè) 4-HNE 水平。需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化應(yīng)激狀態(tài)下均可產(chǎn)生，在實(shí)際應(yīng)用中，一般與其他檢測(cè)方法進(jìn)行相互驗(yàn)證，以提高結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[10]。

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