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32次dànbáizhì組學(xué)是一門以dànbáizhì組為研究對象,旨在研究細(xì)胞、組織或生物體組成及其變化規(guī)律的學(xué)科。自從1975年O'Farrell和Klose等人建立雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)以來,2-DE技術(shù)憑借其高靈敏度和高分辨率、便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理、可以很好地與質(zhì)譜分析等鑒定方法匹配等優(yōu)點(diǎn)成為目前dànbáizhì組學(xué)研究的核心手段。
近年來,dànbáizhì組學(xué)的研究重點(diǎn)已從dànbáizhì的鑒定到量化轉(zhuǎn)移。定量的dànbáizhì組學(xué)研究可定義為多個(gè)樣品間dànbáizhì豐度相對差異的研究。盡管一些可選擇的或互補(bǔ)的dànbáizhì組學(xué)技術(shù)正在發(fā)展,如同位素親和標(biāo)簽和多維dànbáizhì鑒定技術(shù),但雙向電泳仍是當(dāng)前僅有的可以同時(shí)分離大量的復(fù)雜的dànbáizhì混合物的關(guān)鍵技術(shù)。
傳統(tǒng)的雙向電泳2-DE在樣品制備、電泳條件及凝膠染色等方面難以保證wánquán一致,因此容易產(chǎn)生膠間差異。這種差異會導(dǎo)致試驗(yàn)的重復(fù)性不佳,敏感度較低,甚至可能掩蓋真實(shí)的生物學(xué)差異或產(chǎn)生誤導(dǎo)性的假陽性結(jié)果。為了解決2-DE技術(shù)存在的缺陷,1997年Unlü et al提出了雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)。
2D-DIGE 技術(shù)的原理是先用不同的熒光染料標(biāo)記dànbáizhì樣品,再使dànbáizhì變性,然后用固定pH梯度凝膠,根據(jù)dànbáizhì電荷差異分離出不同pH值的dànbáizhì帶,再將此膠條置于含SDS 的聚丙烯酰胺凝膠上,根據(jù)dànbáizhì分子量加以分離,并通過多通道激光掃描分析不同dànbáizhì的SDS-PAGE凝膠圖像。其主要步驟:用2種不同的熒光染料(Cy2、Cy3 或 Cy5)標(biāo)記要比較的dànbáizhì樣品;等量均勻混合熒光標(biāo)記后的樣品;使用相同的內(nèi)標(biāo),將混合后的樣品經(jīng)雙向凝膠電泳進(jìn)行分離;在熒光顯微鏡下,用不同的激發(fā)波長來檢測電泳結(jié)果。
圖1. 2D-DIGE技術(shù)的一般流程
2D-DIGE相較于傳統(tǒng)的2-DE具有的顯著優(yōu)勢:
采用熒光標(biāo)記技術(shù),能同時(shí)比較多個(gè)樣品,提高了實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性。
由于熒光標(biāo)記的引入,使得dànbáizhì的分離和檢測更加jīngquè,可以檢測到更細(xì)微的dànbáizhì差異。
引入了內(nèi)標(biāo),更好地消除了試驗(yàn)的偶然誤差,避免了不同凝膠之間的差異,極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。
不需要進(jìn)行電泳后的固定或脫色過程,減少了dànbáizhì特別是低分子量dànbáizhì的損失。
熒光信號的數(shù)字化處理使得數(shù)據(jù)的獲取和分析更加快速和準(zhǔn)確。
百泰派克生物科技提供SDS-PAGE和2D-DIGE電泳服務(wù),結(jié)合Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺與nanoLC-MS/MS納升色譜,為廣大科研工作者提供一站式dànbáizhì組定性及定量服務(wù)。
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