標(biāo)記定量蛋白組學(xué)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，jǐnxiàn于對(duì)蛋白質(zhì)類型及修飾的定性分析已無法滿足科研需求。在此情況下，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，成為近年來生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)組學(xué)的定量技術(shù)是在已知蛋白類型的基礎(chǔ)上，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)給出的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)其表達(dá)量及豐度進(jìn)行定量，可分為靶向和非靶向。其中靶向定量技術(shù)包括多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）技術(shù)和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）技術(shù)，非靶向定量技術(shù)根據(jù)有無標(biāo)記可分為非標(biāo)記定量和標(biāo)記定量技術(shù)，這里主要介紹標(biāo)記定量技術(shù)。

標(biāo)記定量的主要策略是向不同蛋白質(zhì)或多肽樣品中引入具有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的小分子，通過同位素標(biāo)記后所產(chǎn)生的質(zhì)量差來識(shí)別肽段的來源。在同一次質(zhì)譜掃描中化學(xué)性質(zhì)相同的標(biāo)記肽段離子化效率和碎裂模式也相同，因此比較不同的同位素標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度就可以計(jì)算出不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。根據(jù)引入同位素標(biāo)記方式的不同，又可分為體內(nèi)標(biāo)記和體外標(biāo)記兩類。

圖1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分類圖

1、體內(nèi)標(biāo)記定量

體內(nèi)標(biāo)記也可以稱為新陳代謝標(biāo)記。穩(wěn)定同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（SILAC）是zuì經(jīng)典的體內(nèi)標(biāo)記定量技術(shù)，該技術(shù)的基本原理是將輕、重同位素標(biāo)記的必需氨基酸（通常為賴氨酸和jīngānsuān）分別加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，經(jīng)過5-6 個(gè)倍增周期，細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)氨基酸幾乎wánquán被穩(wěn)定同位素標(biāo)記，根據(jù)混合樣品中兩種同位素標(biāo)記肽段呈現(xiàn)的峰強(qiáng)度或面積比例即可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的jīngquè定量。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)記過程與活細(xì)胞的代謝過程相結(jié)合，能夠更真實(shí)地反映生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，且無需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，避免了因分離步驟而引入的誤差。•

缺點(diǎn)：標(biāo)記效率可能受到細(xì)胞代謝狀態(tài)的影響，且標(biāo)記過程易受其他代謝途徑的干擾。•

圖2 SILAC的工作流程

2、體外標(biāo)記定量

基于代謝反應(yīng)的體內(nèi)標(biāo)記定量技術(shù)存在著耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格貴等問題，因而發(fā)展出一系列體外標(biāo)記定量技術(shù)，其中在樣品處理后期進(jìn)行酶促標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

2.1酶促標(biāo)記技術(shù)

這種技術(shù)通過yídànbáiméi的催化作用將一組樣品的肽段C末端16O原子替換成18O，從而使兩組樣品產(chǎn)生分子量的差異，通過比較標(biāo)記肽段和未標(biāo)記肽段的峰面積，即可對(duì)蛋白樣本進(jìn)行定量。

優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，區(qū)域?qū)Ｒ恍愿?，且操作?jiǎn)便，價(jià)格低廉。•

缺點(diǎn)：標(biāo)記穩(wěn)定性差，重復(fù)性不好，分辨率較低。•

2.2化學(xué)標(biāo)記技術(shù)

化學(xué)標(biāo)記是目前蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用zuì廣泛的定量方法，它不會(huì)受到樣品來源的限制，并且可以根據(jù)肽段或者蛋白分子上不同的反應(yīng)基團(tuán)設(shè)計(jì)不同的化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)肽段和蛋白的定量。根據(jù)反應(yīng)基團(tuán)的不同，化學(xué)標(biāo)記可以分為疏基標(biāo)記、氨基標(biāo)記和梭基標(biāo)記等。其中zuì常用的是基于氨基標(biāo)記的同位素標(biāo)記相對(duì)和juéduì定量（iTRAQ）和串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT）技術(shù)。

特點(diǎn)：標(biāo)記過程可控性強(qiáng)，可靈活選擇標(biāo)記物和標(biāo)記物質(zhì)，jīngquè度和準(zhǔn)確性高。•

缺點(diǎn)：依賴化學(xué)反應(yīng)、受環(huán)境影響較大，且標(biāo)記過程可能引入誤差，對(duì)操作人員技術(shù)要求較高。•

圖3 iTRAQ/TMT技術(shù)的工作流程

蛋白質(zhì)標(biāo)記定量在生物醫(yī)學(xué)研究、藥物開發(fā)、疾病診斷等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，特別是在研究蛋白質(zhì)如何在不同條件下表達(dá)和調(diào)控方面。以上幾種標(biāo)記方法在蛋白質(zhì)定量組學(xué)中各有優(yōu)劣，在選擇標(biāo)記方法時(shí)，需要根據(jù)具體的研究需求、實(shí)驗(yàn)條件以及樣本特性進(jìn)行綜合考慮。

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