蛋白測(cè)序是解析蛋白質(zhì)氨基酸排列順序的核心技術(shù)，主要分為傳統(tǒng)化學(xué)法、質(zhì)譜分析法和新興單分子技術(shù)三大類(lèi)。以下是主流方法的原理、流程及適用場(chǎng)景詳解：
?? 一、傳統(tǒng)化學(xué)法：Edman降解
原理：
從蛋白質(zhì)N端逐級(jí)切割氨基酸，通過(guò)苯異硫氰酸酯（PITC）標(biāo)記→環(huán)化裂解→HPLC鑒定釋放的氨基酸衍生物（PTH-AA）。
流程：
變性處理：用6M鹽酸胍解開(kāi)蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)
N端封閉：乙酰化防止非目標(biāo)反應(yīng)
循環(huán)反應(yīng)：
堿性條件與PITC結(jié)合
無(wú)水三裂解N端氨基酸
萃取PTH-AA進(jìn)行HPLC分析
特點(diǎn)：
? 優(yōu)勢(shì)：可測(cè)N端15-60個(gè)氨基酸（純度＞95%時(shí)）
? 局限：
不能處理N端封閉蛋白（如乙?；鞍祝?/span>
通量極低（1樣本/小時(shí)）
需≥10 pmol純化蛋白
應(yīng)用場(chǎng)景：抗體CDR區(qū)短肽驗(yàn)證、重組蛋白N端質(zhì)檢
?? 二、質(zhì)譜分析法（主流技術(shù)）
1. 自上而下（Top-Down）
原理：
完整蛋白離子化（電噴霧ESI）→高分辨質(zhì)譜（如Orbitrap/FT-ICR）直接測(cè)序。
流程：
特點(diǎn)：
保留翻譯后修飾（PTM）信息
需超高性能質(zhì)譜（分辨率＞100,000）
適用分子量＜50 kDa蛋白
2. 自下而上（Bottom-Up）
原理：
蛋白酶解→肽段分離→串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）測(cè)序→算法拼接。
關(guān)鍵步驟：
酶解：Trypsin（切割K/R位點(diǎn)）、Lys-C等
色譜分離：nanoLC梯度洗脫（C18柱）
碎裂方式：
類(lèi)型 適用場(chǎng)景 特點(diǎn)
CID（碰撞誘導(dǎo)解離） 小肽段（＜2 kDa） 易丟失修飾信息
ETD（電子轉(zhuǎn)移解離） 磷酸化/糖基化修飾 保留不穩(wěn)定修飾
HCD（高能碰撞） 通用型（靈敏度高） 碎片覆蓋全面
數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工具：
Mascot、MaxQuant（標(biāo)記定量）
de novo算法：PEAKS（無(wú)需數(shù)據(jù)庫(kù)）
特點(diǎn)：
通量高（可并行數(shù)百樣本）
需μg級(jí)蛋白起始量
可定位修飾位點(diǎn)（如磷酸化Ser/Thr）
?? 三、單分子測(cè)序技術(shù)
1. 納米孔蛋白測(cè)序（Oxford Nanopore）
原理：
蛋白變性為線性多肽→通過(guò)納米孔時(shí)引起電流變化→AI解碼氨基酸序列。
突破性：
直接讀取翻譯后修飾（如磷酸化酪氨酸電流特征）
2023年實(shí)現(xiàn)單分子精度（誤差＜5%）
2. 熒光標(biāo)記測(cè)序（Fluorosequencing）
流程：
將20種氨基酸分為5組，每組用特異熒光染料標(biāo)記
蛋白固定于載玻片，逐輪切除N端氨基酸
每輪顯微成像識(shí)別熒光顏色→對(duì)應(yīng)氨基酸組
特點(diǎn)：
適合低豐度蛋白（zeptomole級(jí)）
商業(yè)平臺(tái)：Erisyon™（2024年推出）
?? 四、方法選擇決策樹(shù)
?? 五、前沿進(jìn)展與挑戰(zhàn)
AI輔助：
AlphaFold2預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)輔助序列驗(yàn)證
DeepMSn實(shí)現(xiàn)95%準(zhǔn)確度的de novo測(cè)序
挑戰(zhàn)：
膜蛋白等難溶樣本的處理
同分異構(gòu)體（如Leu/Ile）區(qū)分
單氨基酸變異（SAV）檢測(cè)限＞0.1%
實(shí)用建議：
常規(guī)研究Bottom-Up質(zhì)譜（成本≈¥800/樣本）
抗體藥物開(kāi)發(fā)需結(jié)合Edman降解+質(zhì)譜
探索性研究關(guān)注納米孔實(shí)時(shí)測(cè)序（通量＞100樣本/天）
