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　　一、有限稀釋法

　　材料：

　　a、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等;

　　b、HT培養(yǎng)基;

　　c、活力強的雜交瘤細(xì)胞;

　　d、小鼠腹腔細(xì)胞。

　　方法：

　　a、制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的方法。

　　b、制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細(xì)胞三種不同的稀釋度。

　　c、按每毫升加入5×104-1×105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。

　　d、每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10。

　　e、37℃、7.5% CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體;在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。

　　f、取抗體檢測陽性孔的細(xì)胞擴大培養(yǎng)，并凍存。

　　g、本法中(b)、(c)、(d)也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細(xì)胞，按每孔接種0.1ml細(xì)胞懸液，即每孔含1個細(xì)胞。

　　二、軟瓊脂法

　　材料：

　　a、HT培養(yǎng)基(雙倍濃度)。

　　b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0%瓊脂糖：稱取2.0g細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4℃保存。

　　c、小鼠腹腔細(xì)胞。

　　d、滅菌平皿。

　　e、45℃水浴。

　　f、活力很好的雜交瘤細(xì)胞。

　　方法：

　　a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞(小鼠腹腔細(xì)胞)單層。

　　b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃水浴中溫育。

　　c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。

　　d、取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。

　　e、37℃、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天;克隆生長至2mm時，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴大培養(yǎng)。

　　f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、凍存。