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JHM陳少良：PeANN1可作為植物修復(fù)候選基因緩解鎘脅迫
NMT作為生命科學(xué)底層核心技術(shù)，是建立活體創(chuàng)新科研平臺(tái)的*技術(shù)。2005年~2020年，NMT已扎根中國(guó)15年。2020年，中國(guó)NMT銷往瑞士蘇黎世大學(xué)，正式打開(kāi)歐洲市場(chǎng)。
基本信息
主題：PeANN1可作為植物修復(fù)候選基因緩解鎘脅迫
期刊：Journal of Hazardous Materials
影響因子：9.038
研究使用平臺(tái)：NMT重金屬創(chuàng)新平臺(tái)
標(biāo)題：Populus euphratica annexin1 facilitates cadmium enrichment in transgenic Arabidopsis
作者：北京林業(yè)大學(xué)陳少良、張一南
檢測(cè)離子/分子指標(biāo)
Cd2+、Ca2+
檢測(cè)樣品
擬南芥（WT,Atann1, PeANN1-OE1, PeANN1-OE2）根分生區(qū)（距根尖200 μm根表上的點(diǎn)）
中文摘要
植物修復(fù)技術(shù)為重金屬（heavy metal, HM）污染土壤和水體的修復(fù)提供了巨大的潛力。篩選和確定與HM吸收和運(yùn)輸有關(guān)的候選基因是通過(guò)基因工程改善植物修復(fù)的先決條件。本研究以鎘（Cd）敏感型胡楊為材料，鑒定了一個(gè)促進(jìn)Cd富集的膜聯(lián)蛋白編碼基因。用CdCl2（50-100 μM）處理12 h后, 胡楊細(xì)胞下調(diào)了annexin1 （PeANN1）的轉(zhuǎn)錄水平。PeANN1與擬南芥Annexin1（AtANN1）同源，并且主要定位于質(zhì)膜（PM）和細(xì)胞溶質(zhì)。與野生型和Atann1突變體相比，PeANN1在擬南芥中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致長(zhǎng)期Cd脅迫（10 d, 50 μM）后植物的存活率和根長(zhǎng)下降更為明顯，這是由于根部Cd積累較多造成的。PeANN1轉(zhuǎn)基因植株的根在鎘激（30 min，50 μM）和短期脅迫（12 h，50 μM）下表現(xiàn)出增強(qiáng)的Cd2+內(nèi)流傳導(dǎo)。值得注意的是，PeANN1促進(jìn)的Cd2+內(nèi)流被鈣滲透通道（CaPC）抑制劑（GdCl3）顯著抑制，但被1 mM H2O2促進(jìn)，表明Cd2+通過(guò)PM中的自由基激活的CaPCs進(jìn)入根細(xì)胞。因此，PeANN1可以作為通過(guò)基因工程改善植物修復(fù)的候選基因。
離子/分子流實(shí)驗(yàn)處理方法
7日齡擬南芥幼苗，
① 分別在0、50 μМ CdCl2的MS液體培養(yǎng)基中12 h
② 用50 μМ CdCl2實(shí)時(shí)處理
③ 分別在0、50 μМ CdCl2的MS液體培養(yǎng)基中12 h，然后用1.0 mM H2O2實(shí)時(shí)處理
④ 分別在0、50 μМ CdCl2的MS液體培養(yǎng)基中12 h，之后在50 μM CdCl2存在下，用500 μM GdCl3對(duì)CdCl2處理的植物再進(jìn)行30 min的預(yù)處理
圖1.CdCl2和GdCl3對(duì)WT、Atann1突變體和PeANN1轉(zhuǎn)基因系中Cd2+穩(wěn)態(tài)流速的影響
圖2. CdCl2對(duì)擬南芥根中Cd2+實(shí)時(shí)流速的影響
圖3. H2O2對(duì)WT、Atann1突變體和PeANN1轉(zhuǎn)基因系中Cd2+或Ca2+實(shí)時(shí)流速的影響
其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示，CdCl2處理顯著降低了胡楊愈傷組織中PeANN1轉(zhuǎn)錄水平。
PeANN1的cDNA全長(zhǎng)序列為951bp，編碼一個(gè)有316個(gè)氨基酸的假定蛋白。
系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PeANN1與Gossypium barbaense和Lavatera thuringiaca的附件蛋白高度同源。
PeANN1-GFP主要位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，與質(zhì)膜（PM）標(biāo)記FM4-64和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）標(biāo)記ER-CFP共定位，表明PeANN1可能在ER中產(chǎn)生，并通過(guò)分泌途徑進(jìn)入PM。
在無(wú)鎘條件下，PeANN1-OE1和PeANN1-OE2的植株生長(zhǎng)與WT和Atann1的植株生長(zhǎng)沒(méi)有太大差異。然而，WT和PeANN1-轉(zhuǎn)基因株系的存活率和根長(zhǎng)在CdCl2處理10 d后有所下降。與WT相比，PeANN1-轉(zhuǎn)基因株系對(duì)CdCl2的抑制更為明顯。突變體Atann1在長(zhǎng)期CdCl2脅迫后，根系生長(zhǎng)減少較少，存活率沒(méi)有下降。
CdCl2脅迫后，細(xì)胞Cd2+濃度顯著增加。PeANN1-轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出比WT根更高的熒光強(qiáng)度。Atann1突變體則保持了較低的Cd2+熒光強(qiáng)度。
結(jié)論
圖4.鎘脅迫下PeANN1-促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥Cd2+富集的示意圖模型
測(cè)試液
Cd2+：0.05 mM CdCl2, 0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl2, pH 5.7
Ca2+：0.1 mM NaCl, 0.1 mM KCl, 0.2 mM CaCl2, pH 5.7