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動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方法和注意事項(xiàng)
檢測(cè)樣品:動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞
檢測(cè)項(xiàng)目:動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞分離
方案概述:外周血中的干/祖細(xì)胞比例明顯增高。動(dòng)員外周血是指用有效的動(dòng)員劑對(duì)供者進(jìn)行動(dòng)員后采集的外周血。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)是外周血?jiǎng)訂T的動(dòng)員劑,它可選擇性的作用于粒系造血祖細(xì)胞,促進(jìn)其增殖、分化,并可增加外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目和功能。
正常人外周血中的干/祖細(xì)胞的含量占有核細(xì)胞數(shù)的1%左右,經(jīng)有效動(dòng)員后,骨髓中的造血干細(xì)胞會(huì)釋放到外周血中,使外周血中的干/祖細(xì)胞比例明顯增高。動(dòng)員外周血是指用有效的動(dòng)員劑對(duì)供者進(jìn)行動(dòng)員后采集的外周血。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)是外周血?jiǎng)訂T的動(dòng)員劑,它可選擇性的作用于粒系造血祖細(xì)胞,促進(jìn)其增殖、分化,并可增加外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目和功能。動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞是采集經(jīng)動(dòng)員后的健康供者的外周血,采用密度梯度離心的方法提取其單個(gè)核細(xì)胞,其各亞型細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞免疫表型、分泌細(xì)胞因子能力和增殖能力等可能會(huì)與未動(dòng)員外周血有一定差異。
1 原理
單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與其它細(xì)胞不同,在沉降過(guò)程中不同比重的細(xì)胞會(huì)處于不同的分布位置。因此,可利用各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)。
2 方法
1) 取新鮮抗凝動(dòng)員外周血,按照1:1比例加入1×稀釋洗滌液,將血液進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄒ越档脱赫吵矶龋?,輕柔混勻,備用。
2) 向無(wú)菌離心管內(nèi)加入適量的單個(gè)核細(xì)胞分離液,將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方(分離液:稀釋動(dòng)員外周血=1:2),保持兩液面界面清晰。
3) 800g,室溫,離心 20min-30min(注:設(shè)置較慢的加速度和減速度,如果有十檔,設(shè)為第三檔)。
4) 離心結(jié)束后,吸棄血漿層,小心吸取PBMC層(即白膜層)并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后,管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細(xì)胞層(見(jiàn)圖1)。
圖1 稀釋動(dòng)員外周血離心前后的分層狀態(tài)圖
5) 向離心管中加入10mL 重懸細(xì)胞,250g,室溫離心 10min ,棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次,即可用于后續(xù)試驗(yàn)。
3 注意事項(xiàng)
1) 血液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素,請(qǐng)盡量使用采集后24h內(nèi)的血液進(jìn)行PBMC分離。
2) 為保證細(xì)胞的活力,整個(gè)操作過(guò)程請(qǐng)輕柔,避免對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性的損傷。
3) 為保持細(xì)胞狀態(tài)良好,請(qǐng)盡量縮短整個(gè)試驗(yàn)的周期。
4 動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒
IPHASE/匯智和源針對(duì)動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞分離的特點(diǎn),開(kāi)發(fā)了對(duì)應(yīng)的單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒。該試劑盒包含單個(gè)核細(xì)胞分離液和洗滌液兩個(gè)組分,各成分對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,不會(huì)影響細(xì)胞的原始狀態(tài);同時(shí),該試劑盒操作簡(jiǎn)單便捷,可大大縮短細(xì)胞分離時(shí)間,分離所得細(xì)胞純度高、狀態(tài)好、得率高。
5 相關(guān)產(chǎn)品
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