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Ficoll密度梯度離心法分離PBMC
檢測樣品:PBMC
檢測項(xiàng)目:分離PBMC
方案概述:外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞,包括淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)、單核細(xì)胞(Monocyte)、樹突狀細(xì)胞(DC)和其他少量細(xì)胞。
外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞,包括淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)、單核細(xì)胞(Monocyte)、樹突狀細(xì)胞(DC)和其他少量細(xì)胞。
1 原理
單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其它細(xì)胞不同,紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過1.080,單個(gè)核細(xì)胞的比重為1.070左右,血小板為1.030左右。因此,可利用各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離開來。
Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC的方法。Ficoll是蔗糖的多聚體,中性,平均分子量400000,當(dāng)密度為1.2g/mL,未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜,故常用作PBMC分離的分離液。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大,離心后沉于管底;淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分離液比重,離心后漂浮于分離液的液面上,也可有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分層液液面上的白膜層細(xì)胞,并進(jìn)行適當(dāng)?shù)那逑矗涂蓮耐庵苎蟹蛛x到較高純度的單個(gè)核細(xì)胞,即PBMC。
2 方法
1)取新鮮抗凝全血,按照1:1比例加入1×稀釋洗滌液,將血液進(jìn)行稀釋(以降低血液粘稠度),輕柔混勻,備用。
2)向無菌離心管內(nèi)加入適量的單個(gè)核細(xì)胞分離液,將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方(分離液:稀釋全血=1:2),保持兩液面界面清晰。
3)800g,室溫,離心 20min-30min(注:設(shè)置較慢的加速度和減速度,如果有十檔,設(shè)為第三檔)。
4)離心結(jié)束后,吸棄血漿層,小心吸取PBMC層(即白膜層)并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后,管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細(xì)胞層(見圖1)。
圖1 稀釋外周血離心前后的分層狀態(tài)圖
5)向離心管中加入10mL 的1×稀釋洗滌液重懸細(xì)胞,250g,室溫離心 10min ,棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次,即可用于后續(xù)試驗(yàn)。
3 注意事項(xiàng)
1)不同種屬動(dòng)物單個(gè)核細(xì)胞的比重有一定差異,請(qǐng)選擇合適的分離液進(jìn)行PBMC的分離。
2)血液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素,請(qǐng)盡量使用采集后24h內(nèi)的血液進(jìn)行PBMC分離。
3)為保證細(xì)胞的活力,整個(gè)操作過程請(qǐng)輕柔,避免對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性的損傷。
4)為保持細(xì)胞狀態(tài)良好,請(qǐng)盡量縮短整個(gè)試驗(yàn)的周期。
4 相關(guān)產(chǎn)品
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