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淺析ELISA四種常見檢測方法2022/04/07
1、直接ELISA將抗原固定于ELISA板上,然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。相較于其它類型的ELISA實(shí)驗(yàn),直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少,檢測速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反應(yīng),測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與ELISA板結(jié)合,實(shí)驗(yàn)背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,實(shí)驗(yàn)不太靈活。另外由于沒有使用二抗,信號沒有被放大,降低了測定的靈敏度。2、間接ELISA先將抗原結(jié)合到ELISA板上,隨后分
淡天藍(lán)鏈霉菌Streptomyces培養(yǎng)2022/03/23
淡天藍(lán)鏈霉菌Streptomyces的培養(yǎng):1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種(一級種)、原種(二級種)和栽培種(三級種)三級。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種,其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩。2、挑選具有某種能力的有用菌種,也稱種子制備,是指菌種在一定條件下,經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備(見圖)菌種制備,其中(1)~(4)為孢子制備過程。4、保存在沙土管或冷凍管中的
細(xì)胞凍存操作步驟2022/03/15
細(xì)胞凍存操作步驟:1、預(yù)先配制凍存液:凍存液比例多種,根據(jù)細(xì)胞的特性進(jìn)行調(diào)整凍存液的比例:5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液;2、取對數(shù)生長期的細(xì)胞,去除舊培養(yǎng)液,用PBS清洗1-2次;去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清;3、加入適量胰酶(濃度一般為0.25%),使胰酶覆蓋整個瓶,放入培養(yǎng)箱消化;4、細(xì)胞消化0.5-2min(具體時間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷),顯微鏡下觀察細(xì)胞,細(xì)胞胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間不再連接成片,此時加入*培養(yǎng)基終止消化;5、用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞,形成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞
?抗體的特異性免疫反應(yīng)有幾種2022/03/07
抗體是由各種抗原激活淋巴細(xì)胞,淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟為漿細(xì)胞而產(chǎn)生的,是機(jī)體的特異性免疫反應(yīng),抗原可以包括以下幾種:第一、各種病原微生物感染之后,微生物的表面的蛋白可以作為抗原激活體內(nèi)的淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體;第二、可以是致敏原,這種致敏原進(jìn)入到體內(nèi)之后可以產(chǎn)生抗體IgE,等到再次接觸過敏原的時候可以引起過敏反應(yīng),即變tai反應(yīng);第三、先天存在的,比如ABO血型的抗原,所以針對ABO血型的抗體也是先天存在的,一般是IgM抗體,對于病原微生物進(jìn)入到體內(nèi)之后可以產(chǎn)生兩種抗體,一種是I
簡介蛋白定量主要的兩種方法2022/03/01
蛋白定量的方法有很多種,應(yīng)用較多的主要有兩種:BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法,市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測方法而開發(fā)的。兩種方法均需配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,蛋白與定量試劑經(jīng)過一定時間的反應(yīng)(BCA法反應(yīng)為37℃、20-30min,Bradford法反應(yīng)一般為37℃,5min),酶標(biāo)儀讀取樣品的OD值,繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算WB蛋白的濃度。兩種檢測方法相比BCA法,Bradford法不僅節(jié)省反應(yīng)時間,也無需配置反應(yīng)試劑,簡單、快速、好用,推薦Bradford
細(xì)胞因子根據(jù)主要功能分類2022/02/22
1.白細(xì)胞介素(interleukin,IL)1979年開始命名。由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或其它非單個核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,在細(xì)胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)、造血以及炎癥過程中起重要調(diào)節(jié)作用,凡命名的白細(xì)胞介素的cDNA基因克隆和表達(dá)均已成功,已報道有三十余種(IL-1―IL-38)。2.集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)根據(jù)不同細(xì)胞因子刺激造血干細(xì)胞或分化不同階段的造血細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中形成不同的細(xì)胞集落,分別命名為G(粒細(xì)胞)-CSF、M(巨噬細(xì)胞)-CSF、GM
單克隆抗體的制備凍存及純化2022/02/15
單克隆抗體的制備和凍存:篩選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備,因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時間延長,發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法,即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng),在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備,一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基,以利于單克隆抗體的濃縮和純化。*普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠,先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射,一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生,每只小鼠可收集5~10ml的腹
穩(wěn)定細(xì)胞株篩選2022/01/27
方法一:先把質(zhì)粒整合到染色體上后,用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標(biāo)志來篩選該細(xì)胞系,單克隆篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。第一步:篩選濃度測定,以10~14天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度;第二步:進(jìn)行細(xì)胞接種,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞,各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80%覆蓋;第三步:進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染第四步:利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進(jìn)行篩選,并鑒定篩選結(jié)果。方法二:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒,慢病毒轉(zhuǎn)染,篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機(jī)整合進(jìn)基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定
冷凍切片實(shí)驗(yàn)操作步驟及注意點(diǎn)2022/01/20
操作步驟:1、取出組織支承器,放平擺好組織,周邊滴上包埋劑,速放于冷凍臺上冰凍,用吸熱器壓住組織,至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片(1~3分種)。2、將冷凍好的組織塊,夾緊于切片機(jī)持承器上,啟動粗進(jìn)退鍵,轉(zhuǎn)動旋鈕,將組織修平。3、調(diào)好欲切的厚度,根據(jù)不同的組織而定,原則上是細(xì)胞密集的薄切,纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切,一般在5~10μm間。4、調(diào)好防卷板。制作冰凍切片,關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上,這就要求操作者要細(xì)心,準(zhǔn)確地將其調(diào)較好,調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時,以切出完整、平滑的切片為準(zhǔn)。切好的組織
小鼠鈣衛(wèi)蛋白elisa試劑盒試劑配制過程2022/01/11
1、標(biāo)準(zhǔn)品(1)從試劑盒中取出支標(biāo)準(zhǔn)品,于6000-10000rpm離心30。用1ml樣本稀釋液溶解,并用吸頭對準(zhǔn)凍存管底部反復(fù)吸打5次以助溶解,充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)品S7,放置備用。(2)取7個1.5ml離心管(S0-S6)依次排列,各加入250μl樣本稀釋液。吸取250μl標(biāo)準(zhǔn)品S7到*個離心管中(S6),輕輕吹打混勻。從S6中吸取250μl到第二個EP管中(S5),輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0為樣本稀釋液。2、洗液工作液濃洗滌液按1:25倍用去離子水進(jìn)行稀釋。例如用量筒量取
小鼠細(xì)胞培養(yǎng)方法有哪些2022/01/05
小鼠細(xì)胞培養(yǎng)方法:1、細(xì)胞傳代:細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗-2次;②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆蓋整個瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;③-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;若細(xì)胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;④將細(xì)胞懸液000RPM左右條件下離心4min,棄上清;⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;⑥懸浮細(xì)胞直接離心
逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR具體操作步驟2021/12/27
逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR原理:提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR操作步驟:一、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA(反應(yīng)體系要20ul)依次加入1、Oligo(dT)加入1ul。2、RNA(體積即上一步驟計(jì)算出來的)3、剩下的用無Rnase水補(bǔ)齊共12ul65℃水浴5m
為什么溫度是微生物生長最重要影響因素2021/12/22
微生物與所處的環(huán)境之間具有復(fù)雜的相互影響和相互作用:一方面,各種各樣的環(huán)境因素對微生物的生長和繁殖有影響,另一方面,微生物生長繁殖也會影響和改變環(huán)境.研究環(huán)境因素與微生物之間的關(guān)系,可以通過控制環(huán)境條件來利用微生物有益的一面,同時防止它有害的一面。溫度是影響微生物生長的最重要因素之一。溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在:1、影響酶活性,溫度變化影響酶促反應(yīng)速率,最終影響細(xì)胞合成。2、影響細(xì)胞膜的流動性,溫度高,流動性大,有利于物質(zhì)的運(yùn)輸,溫度低,流動性降低,不利于物質(zhì)運(yùn)輸,因此,溫度3、變化影響營養(yǎng)物
介紹細(xì)胞因子受體相關(guān)常識2021/12/15
細(xì)胞因子通過結(jié)合細(xì)胞表面相應(yīng)的細(xì)胞因子受體而發(fā)揮生物學(xué)作用。細(xì)胞因子和其受體的結(jié)合是細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動刺激。已知的細(xì)胞因子受體絕大多數(shù)是跨膜蛋白,由胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成。細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后啟動復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)分子間的相互作用,zui終引起細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的變化,這一過程稱為細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞因子和其受體的結(jié)合是細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動刺激。已知的細(xì)胞因子受體絕大多數(shù)是跨膜蛋白,由胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成。胞膜外區(qū)為識別結(jié)合細(xì)胞因子的部位,胞漿區(qū)啟動受體激活后的信號
有關(guān)ELISA試劑盒使用操作方法2021/12/09
在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中,必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是:加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以,有時候一份標(biāo)本用相同的elisa試劑盒這次測定為陽性,下次測定為陰性,往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。ELISA試劑盒操作方法:各種類型ELISA測定時一般需經(jīng)過這些步驟:固相包被→加待測樣品→溫育→洗滌+加酶標(biāo)物→
簡述ELISA基本原理2021/11/29
酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等,具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)?;驹硭捎每乖c抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接,然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng),用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑:1、固相的抗原或抗體(免疫吸附劑)2、酶標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物)3、酶作用的底物(顯色劑)測量時,抗原(抗體)先結(jié)合在固相載體上,但仍
了解細(xì)胞培養(yǎng)中關(guān)鍵步驟2021/11/24
1、準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試等。2、取材在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞(視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?,?jīng)過一定的處理(如消化分散細(xì)胞、分離等)后接入培養(yǎng)器血中,這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng),實(shí)際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng),分化程度低的組織比分化高的容
讓細(xì)胞活躍的六個實(shí)用對策2021/11/17
細(xì)胞,生物學(xué)名詞,生物體的結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。一般具有細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。植物細(xì)胞的細(xì)胞膜外還有細(xì)胞壁。體形極微,在顯微鏡下始能窺見。形狀多種多樣,主要由細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成,表面有薄膜。動植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致相同。植物細(xì)胞質(zhì)膜外有細(xì)胞壁,細(xì)胞壁中常有質(zhì)體,動物細(xì)胞質(zhì)中常有中心體,而高等植物細(xì)胞中則無。細(xì)胞有運(yùn)動、營養(yǎng)和繁殖等機(jī)能。細(xì)胞是許多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的主角。如果細(xì)胞心情不好,那么實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也不會好到哪兒去。如何讓細(xì)胞快樂?下面就仔細(xì)了解一下吧!1.確保所有實(shí)驗(yàn)室材料都無菌交叉污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大
詳述標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制步驟2021/11/08
標(biāo)準(zhǔn)溶液的定義:標(biāo)準(zhǔn)溶液指的是具有準(zhǔn)確已知濃度的試劑溶液,在滴定分析中常用滴定劑。在其他的分析方法中用標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制工作曲線或作計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度標(biāo)定:標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度標(biāo)定因配置溶液不同而有所不同。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法有兩種:1、直接配制法在分析天平上準(zhǔn)確稱取一定量已干燥的基準(zhǔn)物溶于水后,轉(zhuǎn)入已校正的容量瓶中用水稀釋至刻度,搖勻,即可算出其準(zhǔn)確濃度。2、標(biāo)定法很多物質(zhì)不符合基準(zhǔn)物生物條件,不能直接配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。一般先將這些物質(zhì)配成近似所需濃度溶液,再用基準(zhǔn)物測定其準(zhǔn)確濃度。標(biāo)定的方法有直接標(biāo)定和
選擇合適的抗體的實(shí)用方法2021/11/03
抗體(英語:antibody),抗體是一類能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。(免疫球蛋白不僅僅只是抗體)是一種由漿細(xì)胞(效應(yīng)B細(xì)胞)分泌,被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等的大型Y形蛋白質(zhì),僅被發(fā)現(xiàn)存在于脊椎動物的血液等體液中,及其B細(xì)胞的細(xì)胞膜表面。一、一抗的選擇檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇,為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體,需要考慮的因素:1.實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的類型一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種分析類型,如:可以應(yīng)用于WB/IHC/ICC/ELISA分析等
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