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引物延伸分析實(shí)驗(yàn)2016/08/22
引物延伸分析用于定量mRNA的量，測(cè)定低豐度的mRNA的種類。另外引物延伸實(shí)驗(yàn)可標(biāo)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5`-端，確定轉(zhuǎn)錄的起始。特異的末端標(biāo)記的引物退火到RNA鏈的互補(bǔ)區(qū)域，隨后用RNA作為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物得到cDNA，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析cDNA。cDNA的長(zhǎng)度為引物的標(biāo)記的核苷酸到RNA-5`末端間的堿基數(shù)，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA,長(zhǎng)度為20-40個(gè)核苷酸，與要分析的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5`末端區(qū)域互補(bǔ)。延伸產(chǎn)物小于150個(gè)核苷酸，可得到*分離效果。
核酸酶的分類與發(fā)展史2016/08/15
分類一、核酸外切酶有些核酸酶能從DNA或RNA鏈的一端逐個(gè)水解下單核苷酸，所以稱為核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶稱為脫氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶稱為核糖核酸外切酶;也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶從3′端開始逐個(gè)水解核苷酸，稱為3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一種3′→5′外切酶，水解產(chǎn)物為5′核苷酸;核酸外切酶從5′端開始逐個(gè)水解核苷酸，稱為5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一種5′→3′外切酶，水解產(chǎn)物為3′核苷酸。二、核酸內(nèi)
平端DNA連接的優(yōu)缺點(diǎn)、要求條件、實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)2016/08/04
T4噬菌體dna連接酶不同于大腸桿菌DNA連接酶，它可以催化平端DNA片段的連接(Sgaramella和Khorana，1972;Sgaramella和Ehrlich，1978)，由于DNA很容易成為平端，所以這是一個(gè)極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的物性，才能使任何DNA分子彼此相連。優(yōu)點(diǎn)：1、沒有連不上的，只有切不開的。平末端連接不牽扯到粘性末端的堿基突出問題，所以，理論上任何兩條DNA序列都能連接在一起，當(dāng)然需要ligase的酶學(xué)作用。這個(gè)不同DNA分子之間的連接帶來了極大地便利，因?yàn)槠侥┒俗?
植物microRNAs合成過程2016/08/01
microRNAs(miRNAs)constitutealargegroupofendogenoussinglestrandedsmallRNAs(19-24nucleotides)havingnegativeregulatoryfunctionongeneexpression.Theyareprocessedfromlongernon-codingRNAswithcharacteristicfold-backstructuresbydouble-strandspecificRNasesofth
大尺度鑒定miRNA靶點(diǎn)新方法2016/07/27
《自然—方法學(xué)》網(wǎng)絡(luò)版近日介紹了瑞士蘇黎世大學(xué)分子生命科學(xué)研究所邁克爾?恩加特納(MichaelOHengartner)研究組發(fā)明的一種大尺度鑒定miRNA靶點(diǎn)新方法。在過去幾年中，隨著實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法的發(fā)展和完善，miRNA靶點(diǎn)的鑒定和預(yù)測(cè)研究取得很大進(jìn)展。然而，全面正確地鑒定miRNA的生物學(xué)相關(guān)靶點(diǎn)依然是個(gè)難點(diǎn)。恩加特納研究組發(fā)明了一種叫做“選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)”(selectedreactionmonitoring，SRM)的方法，該方法利用有針對(duì)性的質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-靶點(diǎn)互作的大尺度
小分子RNA之microRNA綜述2016/07/25
RNA一度被認(rèn)為僅僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過渡”，但越來越多的證據(jù)清楚的表明，RNA在生命的進(jìn)程中扮演的角色遠(yuǎn)比我們?cè)缜霸O(shè)想的更為重要。RNA干擾(RNAinterference)的發(fā)現(xiàn)使得人們對(duì)RNA調(diào)控基因表達(dá)的功能有了全新的認(rèn)識(shí)，更因?yàn)榭梢院?jiǎn)化/替代基因敲除而成為研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science評(píng)選的*科學(xué)成就中RNAi名列。隨著對(duì)小分子RNA研究的不斷深入，研究人員開始認(rèn)識(shí)到：小分子RNA的世界一點(diǎn)都不小。有人推測(cè)：小分子RNA可能代表發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新
大腸桿菌與操縱子學(xué)說2016/07/20
1961年，法國(guó)科學(xué)家莫諾(J·L·Monod，1910-1976)與雅可布(F·Jacob)發(fā)表“蛋白質(zhì)合成中的遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制”一文，提出操縱子學(xué)說，開創(chuàng)了基因調(diào)控的研究。四年后的1965年，莫諾與雅可布即榮獲諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。莫諾與雅可布zui初發(fā)現(xiàn)的是大腸桿菌的乳糖操縱子。這是一個(gè)十分巧妙的自動(dòng)控制系統(tǒng)，這個(gè)自動(dòng)控制系統(tǒng)負(fù)責(zé)調(diào)控大腸桿菌的乳糖代謝。乳糖可作為培養(yǎng)大腸桿菌的能源。大腸桿菌能產(chǎn)生一種酶(叫做“半乳糖苷酶”)，能夠催化乳糖分解為半乳糖和葡萄糖，以便作進(jìn)一步的代謝利用。編碼半乳糖
重組體DNA分子的選擇與鑒定2016/07/18
“選擇”(selection)和“篩選”(screening)的基本含義。選擇，是指通過某種外來附加壓力(或因素)的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法。選擇所涉及的范圍較為廣泛，包括根據(jù)克隆載體提供的表型特征的簡(jiǎn)單選擇(simpleselection)，和根據(jù)突變的互補(bǔ)作用對(duì)克隆基因的直接選擇(directselection)。篩選則是指通過某種特定的方法，從被分析的細(xì)胞群體或基因文庫中，鑒定出真正具有所需要重組DNA分子的特定克隆的過程。一.遺傳檢測(cè)法(1)根據(jù)載體表型特
重組DNA的轉(zhuǎn)化和藍(lán)白篩選2016/07/15
體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能進(jìn)行大量復(fù)制，增殖和表達(dá)，其首要目的是獲得大量的克隆基因。雖然PCR技術(shù)，體外轉(zhuǎn)錄及翻譯系統(tǒng)能部分達(dá)到大量擴(kuò)增的目的，但畢竟受到體外操作的許多限制。重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞zui常用的方法之一就是轉(zhuǎn)化(transformation)。轉(zhuǎn)化這一概念來源于遺傳學(xué)：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變叫轉(zhuǎn)化。很多細(xì)菌如桿菌，鏈霉菌屬能自然發(fā)生轉(zhuǎn)化，其它菌屬包括大腸桿菌自然狀態(tài)下無法發(fā)生轉(zhuǎn)化，但可以通過人工誘導(dǎo)使其處在易于接受外源DNA分子的狀態(tài)即
重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選2016/07/12
質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的dna片段(外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是zui容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。2、帶有相同的粘性末端用相
受體菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法2016/07/04
目的與原理當(dāng)細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)時(shí)，即為感受態(tài)，而用理化手段使細(xì)菌處于感受態(tài)的操作為致敏過程。感受態(tài)細(xì)胞制備是重組基因能否實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)是通過鈣離子來誘導(dǎo)使之成為感受態(tài)細(xì)胞。二、材料和方法1.材料：大腸桿菌2.儀器：離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫水浴，超凈工作臺(tái)，冰柜3.試劑lb培養(yǎng)基，0.1MMgCl2，3mM氯化六氮合高鈷TFB：10MmMES(pH6.3)45MmMnCl210MmCaCl210MmKCl三、操作步驟大腸桿菌在LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)12-16小時(shí)
DNA目的片段的回收方法2016/06/30
一、原理回收目的片段的方法很多，常用的有凍融法，低熔點(diǎn)瓊脂糖法，透析代法、電泳回收法、玻璃孔回收法等。本實(shí)驗(yàn)采用電泳回收法。通過特別的V形電泳槽，將挖出的含有目的片段的凝膠置于V形槽前，接通電泳電源，DNA即進(jìn)入V形管中，回收V形管中溶液即可，V形管較小，回收的DNA片段能保持較高的濃度。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.大量酶切產(chǎn)物的電泳分離：瓊脂糖為0.8%，選用大型電泳槽及厚梳子，并載低電壓下電泳以提高分辨率。2.紫外燈下用刀片小心切出含1000bpDNA片段的凝膠。3.把凝膠片置于特制的V型槽平臺(tái)上，在V
RNAi的作用機(jī)制及其放大效應(yīng)2016/06/28
RNAi的作用機(jī)制RNAi的作用體現(xiàn)在兩種水平上①轉(zhuǎn)錄水平。RNA可以介導(dǎo)DNA的甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)zui早發(fā)現(xiàn)于一種植物的類病毒系統(tǒng)。dsRNA(double-strandRNA)被降解成21～23個(gè)核苷酸長(zhǎng)的小片段RNA時(shí)，這些小的RNA分子在細(xì)胞核可以誘發(fā)同源序列的DNA甲基化。這種序列特異性的甲基化的信號(hào)與RNA-DNA結(jié)合有關(guān)。當(dāng)dsRNA含有與啟動(dòng)子同源的序列，即可使同源靶啟動(dòng)子序列甲基化，從而使靶啟動(dòng)子失去功能，導(dǎo)致下游基因沉默
microRNAs技術(shù)簡(jiǎn)介2016/06/22
micrornAs(miRNAs)是一種小的，類似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在植物、動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，miRNA組織特異性和時(shí)序性，決定組織和細(xì)胞的功能特異性，表明miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。盡管在10年前已經(jīng)發(fā)表了*篇關(guān)于miRNA的論文，直到zui近miRNA的普遍性和重要性才逐漸被
DNA的限制性酶切及電泳分析實(shí)驗(yàn)方法2016/06/15
基本原理限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶(水解磷酸二酯鍵)。根據(jù)酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶就是Ⅱ型酶。主要試劑重組質(zhì)粒DNA插入片段300bp本實(shí)驗(yàn)所用限制性核酸內(nèi)切酶為EcoRⅠ，其識(shí)別順序?yàn)椋?′----G↓AATTC----3′3′----CTTAA↑G----5′磷酸二脂鍵斷裂產(chǎn)生5′粘性末端。操作步驟1.反應(yīng)體系的建立：⑴在一無菌1.5mleppendorf管中加入：無菌雙
mRNA的分離純化2016/06/02
真核生物的mRNA分子是單順反子，是編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。真核生物的所有蛋白質(zhì)歸根到底都是mRNA的翻譯產(chǎn)物，因此，高質(zhì)量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cdna文庫構(gòu)建效率的決定性因素。哺乳動(dòng)物平均每個(gè)細(xì)胞含有約1x10-5?gRNA，理論上認(rèn)為每克細(xì)胞可分離出5～10mgRNA。其中rRNA為75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA僅占1%～5％，并且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，表達(dá)豐度也不一樣。真核生物mRNA有特征性的結(jié)構(gòu)，即具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3
JM109，DH，BL21感受態(tài)有何區(qū)別2016/05/30
1：DH菌株DH是一種常用于質(zhì)?？寺〉木辍.coliDH在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株?；蛐停篎-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3)菌株該菌株用于表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合
小RNA與蛋白質(zhì)的相互作用2016/05/25
摘要：小分子調(diào)控RNA，包括siRNA(smallinterferingRNA)、miRNA(micrornA)和piRNA(piwiinteractingRNA)、hsRNA(heterochromatinassociatedsmallRNA)等，是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明，這些小分子RNA存在于幾乎所有較高等的真核生物細(xì)胞中，對(duì)生物體具有非常重要的調(diào)控功能。它們通過各種序列特異性的RNA基因沉默作用，包括RNA干擾(RNAi)、翻譯抑制、異染色質(zhì)形成等，調(diào)控諸如生長(zhǎng)發(fā)育
植物DNA的提取與測(cè)定2016/05/23
一、目的隨著基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，人們經(jīng)常需要提取高分子量的植物DNA，用于構(gòu)建基因文庫、基因組southern分析、酶切及克隆等，這是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的重要步驟。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從植物材料中提取和測(cè)定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，進(jìn)一步了解DNA的性質(zhì)。二、原理細(xì)胞中的DNA絕大多數(shù)以DNA-蛋白復(fù)合物（DNP）的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。提取DNA時(shí)，一般先破碎細(xì)胞釋放出DNP，再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質(zhì)，zui后用乙醇把DNA從抽提液中沉淀出來。DN
DNA測(cè)序原理和方法2016/05/16
DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序，手工測(cè)序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國(guó)PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測(cè)序儀，其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中使用zui多的一種型號(hào)。本實(shí)驗(yàn)介紹的是ABIPRISM310型DNA測(cè)序儀的測(cè)序原理和操作規(guī)程?！驹怼緼BIPRISM310型基因分析儀(即DNA測(cè)序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司
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