核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性的測定

我們可以提供的試劑：

<原理>

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代謝中的重要的調(diào)節(jié)酶，是植物中zui豐富的蛋白質(zhì)，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白50％～60％。本實驗用分光光度法測定酶的羧化能力。

在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)與1分子的CO₂結(jié)合，產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使NADH氧化，反應(yīng)如下：

這里1分子CO₂被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可計算Rubisco的活性，由340nm吸光度的變化可計算NADH氧化的量。

為了使NADH的氧化與CO₂的固定同步，從而需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系統(tǒng)。

（一）實驗材料

菠菜葉片、小麥及水稻葉片。

（二）試劑

1、5mmol/L NADH

2、25mmol/L RuBP

3、0.2mol/L NaHCO₃

4、Rubisco提取介質(zhì)：40mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)緩沖液，內(nèi)含10 mmol/L MgCl₂、0.25mmol/L EDTA、5mmol/L還原型谷胱甘肽。

5、反應(yīng)介質(zhì)：100mmol/L Tris-HCl緩沖液，內(nèi)含12mmol/L MgCl₂和0.4 mmol/LEDTA.Na₂，pH7.8。

6、160u/mL磷酸肌酸激酶溶液。

7、160u/mL甘油醛-3-磷酸脫氫酶溶液。

8、50mmol/L ATP

9、50mmol/L磷酸肌酸。

10、160u/mL磷酸甘油酸激酶溶液。

11、菠菜的Rubisco提取液。

（三）儀器設(shè)備

紫外分光光度計，冷凍離心機，勻漿器，移液管，秒表。

<實驗步驟>

1. 酶粗提液的制備

取新鮮菠菜葉片10g，洗凈擦干，放勻漿器中，加入10mL預(yù)冷的提取介質(zhì)，高速勻漿30s，停30s，交替進行3次；勻漿經(jīng)4層紗布過濾，濾液于20000 rpm 4 ℃下離心15min ，棄沉淀；上清液即酶粗提液，置0℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2. Rubisco活力測定

按表20-1配制酶反應(yīng)體系。

將配制好的反應(yīng)體系搖勻，倒入比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計上340nm處反應(yīng)體系的吸光度作為零點值。將0.1mL RuBP加于比色杯內(nèi)，并馬上計時，每隔30s測一次吸光度，共測3min 。以零點到*分鐘內(nèi)吸光度下降的值計算酶活力。

由于酶提取液中可能存在PGA，會使酶活力測定產(chǎn)生誤差，因此除上述測定外，還需做一個不加RuBP的對照。對照的反應(yīng)體系與上述酶反應(yīng)體系*相同，不同之處只是把酶提取液放在zui后加，加后馬上測定此反應(yīng)體系在340nm處的吸光度，并記錄前一分鐘內(nèi)吸光度的變化量，計算酶活力時應(yīng)減去這一變化量。

<結(jié)果計算>

式中：ΔA—反應(yīng)zui初1min內(nèi)340nm處吸光度變化的值（減去對照液zui初1分鐘的變化量）。

N——稀釋倍數(shù)。

6.22——每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)。

2——表示每固定1mol CO₂有2mol NADH被氧化。

Δt——測定時間1min。

d——比色光程，cm。