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Western Blot 實驗出現(xiàn)非特異性條帶原因
實驗結(jié)果出現(xiàn)非特異性條帶的可能原因有①細(xì)胞傳代次數(shù)過多，蛋白表達(dá)不同②體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化等③蛋白樣本降解④檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白⑤一抗?jié)舛冗^高⑥二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生的非特異性結(jié)合⑦抗體未經(jīng)純化⑧目標(biāo)蛋白形成多聚體。
相應(yīng)的處理方法是 ① 使用原始未傳代的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做平行實驗②參考文獻(xiàn)，使用試劑使樣品去甲基化、磷酸化等來證明翻譯后修飾 ③ 在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑 ④ 查閱其它文獻(xiàn)報道，或BLAST搜尋，使用況明書推薦的 細(xì)胞株或組織 ⑤ 降低抗體濃度或縮短孵育時間 ⑥ 降低抗體濃度，加入二抗對照(不加一抗) ⑦ 使用親和純化的抗體，減少非特異性條帶 ⑧ SDS-PAGE 電泳加樣前煮沸10分鐘而不是5分鐘，使蛋白充分解聚。
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