新生牛血清檢測(cè)要求 

本品系從出生14小時(shí)內(nèi)未進(jìn)食的新生牛采血分離血清，經(jīng)除菌過濾后制成。牛血清生產(chǎn)過程中不得任意添加其他物質(zhì)成分。 新生牛血清用于生產(chǎn)前應(yīng)逐批進(jìn)行以下檢查，并應(yīng)符合規(guī)定。  

蛋白質(zhì)含量  應(yīng)為3.5%～5.0%。 

血紅蛋白   用氰化高鐵法或其他適宜的方法測(cè)定。應(yīng)不高于0.02%。

大腸桿菌噬菌體 采用噬斑法和增殖法檢測(cè)。不得有噬菌體污染。

摩爾滲透壓  （指標(biāo)待定） 

無菌檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

支原體檢查     依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 應(yīng)不高于10EU/ml（附錄Ⅻ E 凝膠*試驗(yàn)）。

病毒檢查  

1. 細(xì)胞培養(yǎng)法 

（1）非血吸附病毒檢查  將新生牛血清供試品分別接種到人源（如人二倍體細(xì)胞）、 猴源（如Vero細(xì)胞）以及牛腎傳代細(xì)胞三種細(xì)胞，采用的牛腎傳代細(xì)胞系應(yīng)證明無牛病毒的污染。每種細(xì)胞至少接種6瓶，每瓶細(xì)胞懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25%。于36±1℃培養(yǎng)21天。接種的每種細(xì)胞都應(yīng)同時(shí)設(shè)立牛血清陰性對(duì)照和病毒陽性對(duì)照，（陰性對(duì)照用牛血清應(yīng)證明無牛病毒污染）。培養(yǎng)過程中可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換細(xì)胞培養(yǎng)液，每次更換培養(yǎng)液前應(yīng)觀察（肉眼/顯微鏡）有無細(xì)胞病變出現(xiàn)。培養(yǎng)到期后，陰性對(duì)照應(yīng)無任何細(xì)胞病變出現(xiàn)，陽性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，試驗(yàn)成立。供試品檢查應(yīng)不出現(xiàn)任何細(xì)胞病變?yōu)殛幮裕弦蟆?

（2）血吸附病毒檢查  將上述接種供試品的每種細(xì)胞取2瓶進(jìn)行血吸附病毒檢查。 用0.2%~0.5%雞和豚鼠紅細(xì)胞混合懸液覆蓋于細(xì)胞表面，置2~8℃分鐘， 然后置20~25℃30分鐘， 分別進(jìn)行鏡檢， 觀察紅細(xì)胞吸附情況， 供試品檢查結(jié)果均應(yīng)為陰性。試驗(yàn)同時(shí)應(yīng)設(shè)立血吸附陽性對(duì)照。

 2. 免疫熒光抗體檢查法  采用直接或間接免疫熒光抗體檢查法，至少應(yīng)對(duì)牛腹瀉病毒，牛腺病毒、牛細(xì)小病毒、 呼腸孤病毒、狂犬病病毒以及牛副流感病毒進(jìn)行檢查，結(jié)果均應(yīng)為陰性。                                           

支持細(xì)胞增殖檢查 用Sp2/0 -Ag14或適宜的非貼壁傳代細(xì)胞進(jìn)行。

（1）細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定取供試品按10%濃度配制細(xì)胞培養(yǎng)液，按每1ml含104的細(xì)胞濃度接種細(xì)胞，每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞，連續(xù)觀察一周，并繪制生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞的zui大增殖濃度應(yīng)不低于每1ml含106。 

（2）細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定按生長(zhǎng)曲線計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間。取細(xì)胞峰值前一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)(Y)、接種細(xì)胞數(shù)(X)及生長(zhǎng)時(shí)間(T)計(jì)算。 倍增時(shí)間=T/A  A=log2Y/X  Sp2/0-Ag14細(xì)胞的倍增時(shí)間應(yīng)不超過20小時(shí)。 1.

（3）克隆率的測(cè)定 按有限稀釋法將細(xì)胞稀釋，并按每孔1個(gè)細(xì)胞的濃 度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每板至少接種48孔， 于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)1周后計(jì)算克隆率，應(yīng)不低于70%。 克隆率=A/B×100%  式中 

A為細(xì)胞生長(zhǎng)陽性孔數(shù)； 

B為接種細(xì)胞的總孔數(shù)。