傳代培養(yǎng)中的細(xì)胞傳代培養(yǎng)（subculture），當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對(duì)單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。

2．半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）

此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。

3．貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

1、附著型胞(adherentcell)

（1）吸掉舊培養(yǎng)液。

（2）用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。

（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液。

（4）輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

2、懸浮型細(xì)胞(suspensioncell)

（1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。

（2）吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3、融合瘤(hybridoma)

（1）有些hybridomacell需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。

主要區(qū)別

原代培養(yǎng)：即*次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程。有幾方面含義：

1、培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割，任其生長(zhǎng)繁殖；

2、原代培養(yǎng)中的“代”并非細(xì)胞的“代”數(shù)，因?yàn)榕囵B(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細(xì)胞；

3、原代培養(yǎng)過(guò)程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。

正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無(wú)限生長(zhǎng)下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實(shí)驗(yàn)室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成。此細(xì)胞系一直延用至今。 原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養(yǎng)技術(shù)和方法、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān)。由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化性極小，對(duì)病毒敏感性好，因此適應(yīng)制備疫苗等生物制品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標(biāo)本、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細(xì)胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細(xì)胞。

原代培養(yǎng)的基本過(guò)程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟，在所有的操作過(guò)程中，都必須保持培養(yǎng)物及生長(zhǎng)環(huán)境的無(wú)菌。

多數(shù)情況下，分散的細(xì)胞若屬于貼壁依賴(lài)型細(xì)胞，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長(zhǎng)而形成細(xì)胞單層，這種培養(yǎng)方式稱(chēng)為單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayerculture），又叫貼壁培養(yǎng)（adherentculture）。少數(shù)情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞沒(méi)有貼壁依賴(lài)性，可通過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)備使細(xì)胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長(zhǎng)，這種形式稱(chēng)為懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）。如何讓接種的細(xì)胞盡快貼壁，是決定培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟：

1、取決于適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)基質(zhì)表面；

2、可降低接種后培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的浮力，如先少補(bǔ)加少量培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后再補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；

3、注意適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度，一般105個(gè)/ml左右。

傳代培養(yǎng):當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對(duì)單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代”概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞”與“子代細(xì)胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再一次培養(yǎng)，可以相對(duì)地衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。

實(shí)驗(yàn)原理

傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)。這一過(guò)程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需。傳代要在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，每一步都需要認(rèn)真仔細(xì)的無(wú)菌操作。

實(shí)驗(yàn)材料和器材

材料：培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75%酒精棉球，酒精燈，培養(yǎng)細(xì)胞。

藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，Hanks液。

儀器：C02培養(yǎng)箱，倒置：顯微鏡，超凈臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1．人無(wú)菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。

2．倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預(yù)熱。

3．超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用0.1%新潔爾滅溶液擦凈。

4．打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面20min左右，關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈，打開(kāi)抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。

5．點(diǎn)燃酒精燈；取出無(wú)菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過(guò)酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌試管內(nèi)。

6．將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過(guò)酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

7．倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2—3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。

8．每個(gè)大培養(yǎng)瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。

9．加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7～10mL/大瓶，3～5mL/小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

10．對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做。可將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。

注意事項(xiàng)

1．傳代培養(yǎng)時(shí)要注意無(wú)菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開(kāi)。

2．每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代。

3．如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細(xì)胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗菌素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基等

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

一、原理

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。

傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分

瓶。

二、材料和試劑

1、細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株

2、試劑：0.25%胰酶、1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）

3、儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等

三、操作步驟

1、將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。

2、加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10ml培養(yǎng)液終止消化。

觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見(jiàn)到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為1—3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實(shí)踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。

附：消化液配制方法：

稱(chēng)取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無(wú)Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，濾器過(guò)濾除菌，4℃保存，用前可在37℃下回溫。

胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui終濃度達(dá)0.02%。

養(yǎng)細(xì)胞

在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，盡管人們已經(jīng)能夠重新構(gòu)建牙冠結(jié)構(gòu)，然而重新構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜的牙根始終是不少科研人員的*夢(mèng)想。第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院文玲英教授等在一項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題中，培養(yǎng)出了純化的牙囊細(xì)胞，盡管這離重新構(gòu)建牙根還有很長(zhǎng)的距離，但畢竟又向前邁了一步。 牙囊是牙胚的重要組成部分，隨著牙齒的發(fā)育，由它分化的細(xì)胞形成牙骨質(zhì)、牙周膜和部分牙槽骨，換句話說(shuō)，由牙囊發(fā)育的組織結(jié)構(gòu)主要負(fù)責(zé)將牙齒固定在牙槽骨上。另外在牙齒萌出的過(guò)程中，牙囊細(xì)胞還可能通過(guò)對(duì)一些細(xì)胞和因子進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)牙齒的順利萌出。

牙囊細(xì)胞的重要功能吸引了研究者的目光，但要進(jìn)行深入的研究就需要首先分離出純化的牙囊細(xì)胞。早在上世紀(jì)90年代，國(guó)外就已經(jīng)開(kāi)展了分離牙囊的研究，但由于牙囊與成釉器（上皮來(lái)源）“關(guān)系密切”，始終難以簡(jiǎn)便地獲得純化的牙囊細(xì)胞。

據(jù)研究人員劉曉輝介紹，牙囊細(xì)胞和成釉器分別來(lái)源于外胚間充質(zhì)和口腔上皮，這兩類(lèi)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)對(duì)培養(yǎng)皿具有不同的黏附能力，當(dāng)使用胰酶消化時(shí)，黏附能力較差的牙囊細(xì)胞會(huì)首先掉下來(lái)，成釉器上皮細(xì)胞則要慢一些，這就是差速消化的概念。利用差速消化法，收集牙囊細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，就稱(chēng)為差速傳代技術(shù)。經(jīng)3～4次差速傳代，zui終就可以得到純化的牙囊細(xì)胞了。

在研究過(guò)程中，他們選用大鼠*和第二磨牙牙胚，剝離出牙囊和成釉器作混合培養(yǎng)，經(jīng)3次差速傳代后，成功地從第4代牙胚原代細(xì)胞中獲得了純化的牙囊細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示純化率達(dá)*，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖旺盛。

文教授說(shuō)，差速傳代培養(yǎng)技術(shù)是一種很有效且操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)的研究方法，培養(yǎng)的高純化牙囊細(xì)胞為今后牙齒組織工程提供了種子細(xì)胞，下一步他們準(zhǔn)備將純化牙囊細(xì)胞應(yīng)用于牙根的重新構(gòu)建研究中。

• 酶消化法。
  
  1、胰酶。這是用得zui多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細(xì)胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細(xì)胞間。配制時(shí)不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存于-20度。
  
  2、膠原酶。這種方法比較少，一般是用原代培養(yǎng)時(shí)，從組織消化下細(xì)胞。這種方法作用溫和，對(duì)細(xì)胞損傷較小，但是，價(jià)格也較貴。中止同樣是用血清。
  
  二、離子螯合劑：不破壞細(xì)胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測(cè)細(xì)胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。
  
  1、EDTA。用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用于細(xì)胞與間質(zhì)，對(duì)細(xì)胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶。因此，配制時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)好酸堿度。它不能被終和。因此，消化下來(lái)的細(xì)胞要洗一遍。
  
  2、商品化的無(wú)酶消化液。個(gè)人的使用經(jīng)常覺(jué)得對(duì)細(xì)胞的損傷比較大，但是分離成單細(xì)胞懸液的能力確實(shí)比較強(qiáng)。
  
  三、物理法。直接吹打或用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來(lái)。
  
  四、冷凍法。這是本人做細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的方法。此方法僅能用于細(xì)胞傳代時(shí)。無(wú)法使組織上的細(xì)胞脫落下來(lái)。本方法的原理，我想是因細(xì)胞冷凍后收縮，從而從培養(yǎng)瓶上脫落下來(lái)。優(yōu)點(diǎn)是：對(duì)細(xì)胞損傷小，不需要中止或洗細(xì)胞，方便，不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的細(xì)胞。不足是細(xì)胞常成小片脫落。此種方法曾用于因用其它方法傳代導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡操作的間充質(zhì)干細(xì)胞、DC細(xì)胞的培養(yǎng)，效果非常滿意。具體過(guò)程是：1、用較多的4度的PBS洗滌一遍細(xì)胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作臺(tái)上，很快細(xì)胞就小片脫落，3、輕輕吹打，細(xì)胞即*脫落，4、按一定比例傳代。

細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；3. 離心， 1000rpm，5min；4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。