Vero細(xì)胞傳代方法

 一、傳代前準(zhǔn)備 

1. 用75%酒精棉球擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。 

2. 正確擺放使用的器械，保證足夠的空間，不僅便于操作，而且減少污染。

3. 點(diǎn)燃酒精燈，注意火焰不能太小。 

4. 取出室溫保存的培養(yǎng)液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

二、傳代步驟： 

1. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，注意取出細(xì)胞時(shí)不要碰到瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微 鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。 

2. 打開瓶口：將各個(gè)瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

3. 倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。 

4. 加入500ul/小瓶（培養(yǎng)面積___cm2)的胰酶（4度中可存放幾個(gè)月）,并晃動(dòng) 瓶子,使液體浸潤(rùn)瓶底。

5. 將瓶置入孵箱約2-3分鐘。 

6. 目測(cè)觀察,見細(xì)胞層出現(xiàn)針狀小孔，折光增加，棄去胰酶。

7. 加入3ml的DMEM培養(yǎng)基稀釋,注意更換吸管。 

8. 吹打15-20次左右,剛開始輕吹5次左右，然后用力吹，使細(xì)胞良好地分散 成單個(gè)細(xì)胞，鏡下觀察。

 9. 一傳2，作好記號(hào)，置37℃，5%CO2孵箱。

10. 一般2-3天長(zhǎng)滿。

注意事項(xiàng)： 

1. 操作過程中不能碰到瓶蓋； 

2. 加培養(yǎng)液前移液管燒后先在培養(yǎng)基內(nèi)回吸一次； 

3. 試驗(yàn)結(jié)束后用完的移液管要馬上用水沖洗干凈，再浸泡在洗衣粉溶液內(nèi)；

4. 胰酶消化不開細(xì)胞的，可能是胰酶失效或者細(xì)胞老化； 

5. 如果細(xì)胞長(zhǎng)滿不能及時(shí)傳代就放在室溫下第二天傳，但是只能放一天；

6. 生長(zhǎng)液5%-10%血清，維持液2%-5%血清。  小瓶1傳2小瓶  中瓶1傳4小瓶（或2中瓶）