細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

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   體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

營養(yǎng)成分：

1. 氨基酸：所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱氨酸。
2. 單糖：六碳糖是主要能源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力zui高，半乳糖zui低。 體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
3. 維生素：生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。
4. -無機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。
5. 促生長因子及激素：o各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細(xì)胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用。
6. 滲透壓 ：8 r. s%細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜。
7. pH、氣體：是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體主要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時(shí)，一般置細(xì)胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7.2～7.4，在細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，pH值發(fā)生變化。由于NaHCO₃容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但zui大缺點(diǎn)是在開放培養(yǎng)或觀察時(shí)難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO₂，在封閉式培養(yǎng)過程中CO₂與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO₃-CO₂緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO₂及時(shí)溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO₂濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO₃處于平衡狀態(tài)。
8. 無毒、無污染：體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。

細(xì)胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基：使用zui普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清zui普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞順利增殖生長。

合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機(jī)鹽、維生素、微量無素和細(xì)胞生長因子等。單獨(dú)使用細(xì)胞雖有生存但不能很好的生長增殖。

血清種類

目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用其他動物血清更合適。

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)zui高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對細(xì)胞有害的成分zui少。

血清的主要成分

血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理?xiàng)l件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細(xì)胞生長或抑制生長活性是達(dá)到生理平衡的。

血清主要作用

1. 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。

2. 提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素等。生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

3. 提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。

4. 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。

5. 對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。

血清培養(yǎng)基主要問題

1. 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識，這給研究工作帶來許多困難。

 2. 血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制。

3. 對大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長（成纖維細(xì)胞）同時(shí)抑制另一類細(xì)胞生長（表皮細(xì)胞）。

4. 血清含一些對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡。

5. 動物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。

6. 取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性。

7. 大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成動物細(xì)胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應(yīng)健康無病并且在的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過程應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的《用動物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

2. 有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3. 證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4. 血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

5. 無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細(xì)菌噬菌體污染。

6. 對細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素等。

血清質(zhì)量的鑒定

1. 理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。

其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。

2. 微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細(xì)胞也能生長繁殖，但會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

3. 促生長效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測。有以下方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

（1） 克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細(xì)胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細(xì)胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時(shí)間，統(tǒng)計(jì)有克隆生長的孔，計(jì)算出百分比，再與對照的標(biāo)準(zhǔn)血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細(xì)微差別。

（2） 貼瓶率測定:是以貼壁細(xì)胞為培養(yǎng)對象，將細(xì)胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個(gè)細(xì)胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計(jì)集落數(shù)，計(jì)算出集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比，同樣再與標(biāo)準(zhǔn)血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。

（3） 連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個(gè)一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長狀況，并將每次的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)血清的測試結(jié)果比較。

4. 對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長狀況。

血清的使用與儲存：

正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。

1. 使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細(xì)胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

2. 儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時(shí)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時(shí)間存放，應(yīng)盡快使用。

3. 使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，zui常用是10％。過多血清容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細(xì)胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

采購血清時(shí)，先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗(yàn)，選定一批后就要保留足夠使用6個(gè)月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過預(yù)先試驗(yàn)的樣品代替。

合成細(xì)胞培養(yǎng)基

   合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從zui初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。

基本組分

1. 無機(jī)鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

2. 氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細(xì)胞的培養(yǎng)特別重要，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨(dú)配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

3. 維生素：是維持細(xì)胞生長的一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細(xì)胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素包括生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是*的，對具有合成膠原能力的細(xì)胞更為重要。

4. 碳水化合物：是細(xì)胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

5. 葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不*氧化的產(chǎn)物。體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔@降低了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細(xì)胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個(gè)可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)zui常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)不足，細(xì)胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達(dá)量等參數(shù)進(jìn)行綜合考慮方可應(yīng)用。

在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)*不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細(xì)胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不*氧化途徑，另一小部分通過*氧化為細(xì)胞供能。因此，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進(jìn)細(xì)胞的快速生長和產(chǎn)物合成，同時(shí)減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動物細(xì)胞如CHO、BHK和雜交瘤細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細(xì)胞生長而言，二者的快速利用并非細(xì)胞必需；相反相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細(xì)胞生長以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

6. 除了以上與細(xì)胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

7. 在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)：是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。

無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。 用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當(dāng)其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長。

添加組分促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等

2. 促生長因子及激素：針對不同細(xì)胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細(xì)胞生長、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞*的，如胰島素。

3. 酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中*須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。zui常用的是大豆胰酶抑制劑。

4. 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

5. 微量元素：硒是zui常見的。

使用方法

目前，血清仍是動物細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時(shí)，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：

1. 處于對數(shù)生長中期

2  活細(xì)胞率

3. 適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種

細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法

1.直接適應(yīng)：細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

 一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10⁵～3.5×10⁵細(xì)胞/ml。細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶～3×10⁶細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×10⁶～4×10⁶細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。

細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶～3×10⁶細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

連續(xù)適應(yīng)：分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

 以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

 當(dāng)細(xì)胞密度>5×10⁵細(xì)胞/ml時(shí)，以2×10⁵到3×10⁵細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

 以2×10⁵到3×10⁵細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶到3×10⁶細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

 每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶到3×10⁶細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過程中，不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：

許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生，進(jìn)行2到3次的傳代，使生長率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)

1. 可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

2. 避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。

3. 避免血清組分對實(shí)驗(yàn)研究的影響。

4. 有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。

5. 可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。

缺點(diǎn)：

 1. 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。

2. 成本較高。

3. 針對性很強(qiáng)，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。

無蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基有廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)zui終要應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，zui終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細(xì)胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM)：是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長的CDM問世。

常用細(xì)胞培養(yǎng)基

1. MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列
2. DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列
3. RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列
4. 199細(xì)胞培養(yǎng)基系列
5. 水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基
6. 歐氏平衡鹽
7.細(xì)胞培養(yǎng)基系列
8. 其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基

干粉培養(yǎng)基的配制

注意事項(xiàng)

1. 認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。

2. 配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基*溶解之后才能添加。

3. 配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。

4. 所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。

5. 配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。

6. 液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時(shí)可制成無內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。

配制方法

1. 在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。

2. 在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。

3. 水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。

4. 加NaHCO3到培養(yǎng)基中。

5. 用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分?jǐn)嚢琛?/span>

6. 通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過濾時(shí)會上升0.1到0.3，因而調(diào)節(jié)pH值使它比zui終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。

細(xì)胞培養(yǎng)基的保存

1. 干粉，買了后一定要保存在4度。有人保存在－20度，沒有必要。但4度是非常必要的。保證期是有提示的。
2. 配好的無血清培養(yǎng)基一定保存在4度，保存不要超過3個(gè)月。用時(shí)根據(jù)提示要加入谷胺酰胺。
3. 加入血清的培養(yǎng)基，保存在4度不要超過1個(gè)月，時(shí)間太長，活性下降。當(dāng)然稍微長點(diǎn)也不一定出問題。但是根據(jù)細(xì)胞而定；如果原代培養(yǎng)，新鮮，如果是腫瘤細(xì)胞，或僅維持傳代就不太要緊。但是原則是越新越好。

細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇

1. 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。

2. 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。

3. 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 。

4. 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇*培養(yǎng)基，這是zui客觀的方法，但比較繁瑣。

不同細(xì)胞系適用的培養(yǎng)基表% N) E7 w( N! Y6 p9 r