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PCR儀使用方法

來源:武漢愛斯佩科學儀器有限公司   2010年07月02日 16:37  

(一)試劑PCR儀
 ?。?)引物:決定擴增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同,選用不同引物,每種病原微生
  物都有自己特異的引物。
 ?。?)耐熱的DNA聚合酶:此酶是從耐熱細菌中分離出來的,能耐受高溫90℃-100℃。
  (3)10×PCR緩沖液:500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
 ?。?)5mmol/L dNTP貯備液:將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并,加入滅菌去離子水溶解,用NaOH調(diào)pH至中性,分裝每份300μl,-20℃保存。dNTP濃度用UV吸收法測定?,F(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。
 ?。?)DNA模板:用處理液將待測標本處理,不同處理方法、操作各異,但目的是暴露標本中被檢測的DNA。
  (二)操作程序PCR儀
  過去標準的PCR操作程序是將PCR儀必需反應成份分別加入一微量離心管中,然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下:
 ?。?)向一微量離心管中依次加入
  DNA模板       102-105拷貝
  引物          各1μmol/L
  dNTP        各200μmol/L
  10×PCR緩沖液  1/10體積
  ddH2O     補到終體積(終體積50μl-100μl)
  混勻后,離心15s使反應成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用,現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液,引物,ddH2O混合在一起,反應體積為20-25μl,只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
 ?。?)加石蠟油50-100μl于反應液表面以防蒸發(fā)。置反應管于97℃變性10min。
 ?。?)冷至延伸溫度時,加入1-5u Taq DNA聚合酶,離心30s使酶和反應液充分混合?,F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。
  (4)PCR儀的循環(huán)程序為:94℃變性30s,55℃退火20s,然后在72℃延伸30s,共循環(huán)30-35次。zui后一次循環(huán)結束后,再將反應管置72℃溫育5min,以確保充分延伸。
  PCR儀尚可用于組織標本DNA的擴增。由于固定組織標本的DNA常發(fā)生降解,就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA,再用PCR進行特異性的DNA擴增,應用這種方法,他們成功地從保存30至40年之久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA,操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚,0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂,離心除去二甲苯,用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應基質(zhì),將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min,然后按前述PCR方法進行DNA擴增。
  在應用PCR方法檢測RNA病毒時,首先應將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進行擴增,因為PCR只能對DNA模板進行擴增,我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉(zhuǎn)錄PCR,簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。

文章關鍵詞:PCR儀

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