摘要：

　　共聚焦顯微鏡比寬場顯微鏡具有更多的優(yōu)勢，共聚焦顯微鏡可以對樣品做連續(xù)光學(xué)切片并排除非焦平面的信號干擾，為此共聚焦顯微鏡的應(yīng)用也的確更為普遍。不過市面上各種各樣的共聚焦顯微鏡越來越多，要如何進行選擇呢?

　　共聚焦顯微鏡比寬場顯微鏡具有更多的優(yōu)勢，共聚焦顯微鏡可以對樣品做連續(xù)光學(xué)切片并排除非焦平面的信號干擾，為此共聚焦顯微鏡的應(yīng)用也的確更為普遍。不過市面上各種各樣的共聚焦顯微鏡越來越多，要如何進行選擇呢?在選擇共聚焦顯微鏡時，zui基本也zui重要的考慮因素主要有兩點：您想要研究的樣本類型（如：固定的細胞還是活細胞），以及您想要進行的檢測類型（如：靜態(tài)還是動態(tài)細胞過程）。

　　固定細胞的共聚焦成像

　　要對固定且染色了的細胞或組織成像，我們一般選擇激光掃描共聚焦（LSCM）。這主要是因為固定的死細胞缺乏活細胞中的快速生物學(xué)事件，能更好的受益于LSCM較高的空間分辨率。LSCM成像是通過激光對樣品進行光學(xué)層切，掃描速度（取決于掃描陣鏡速度）一般為1fps。曝光時間越長意味著光漂白的風(fēng)險越大，但對于固定的死細胞，時間并不是很關(guān)鍵，我們可以通過拍多張圖片來平均。

　　活細胞的共聚焦成像

　　成像活細胞需要額外的保護，以免不友好環(huán)境的干擾。在成像時，我們首先需要考慮的是保持細胞的活性和健康，恒溫加熱元件和灌流系統(tǒng)是*的，尤其對于進行time-lapse（時間序列）的研究來說?？刂苹罴毎頎顟B(tài)的快速生化事件是大多數(shù)人zui想要研究的，但這些事件對于傳統(tǒng)LSCM來說太快了。此外，LSCM的長時間曝光還會引發(fā)毒性光照損傷細胞。因此，對活細胞進行成像會需要特殊的共聚焦顯微鏡。

　　對活細胞進行共聚焦成像一般有兩個選擇：快速掃描的激光掃描共聚焦和轉(zhuǎn)盤共聚焦?？焖賿呙韫簿劢癸@微鏡用較快的共振掃描陣鏡（resonant scanning mirrors）取代較慢的galvanometers mirrors，能使掃描速度達到30fps;而轉(zhuǎn)盤共聚焦（SDCMs）的優(yōu)勢在于掃描速度更快（雖然不可避免的要損失空間分辨率），其速度理論上可達到2000fps（實際上往往受到其他因素的限制）。

　　如果您擔(dān)心光漂白或者很弱的熒光信號，那么SDCM可能更加適合。SDCM采用兩個帶有陣列微孔的轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動來分散激發(fā)光，不同于LSCM對樣品進行點掃描，SDCM一次采集多個點（大約100個像素點），因而速度大大增加，并且SDCM的光漂白及光毒性更小。不過，您也可以采用快速掃描共聚焦來提高掃描速度，配合高靈敏檢測器，降低激發(fā)光能量來減少光毒性，這樣能夠保證傳統(tǒng)共聚焦的豐富功能。

　　自動化共聚焦成像系統(tǒng)

　　一些研究者喜歡想方設(shè)法對顯微鏡進行改造，以適應(yīng)自己的個性化需求。而有些研究者則對顯微鏡到底是如何工作的根本不敢興趣。對于后者而言，一臺自動化的共聚焦顯微鏡可能更合他們胃口。舉例來說，Olympus FluoView FV10i就是這樣一臺全自動桌面型4激光共聚焦顯微鏡，其緊湊的整合結(jié)構(gòu)對安裝空間基本沒有要求。這類儀器非常適合那些需要每天做很多圖像數(shù)據(jù)采集的研究者，當(dāng)然它們并不能*體現(xiàn)傳統(tǒng)共聚焦的功能及靈活擴展性。此外，Nikon A1也是一套全自動共聚焦系統(tǒng)。與大多數(shù)傳統(tǒng)共聚焦掃描顯微鏡一樣，Nikon A1采用galvanometer掃描頭，其分辨率比采用混合式掃描頭的A1R高，但速度稍遜（A1R約30fps）。

　　增加對各種共聚焦顯微鏡類型的了解，可以幫您找到zui適用的儀器。如今，即使不考慮全自動系統(tǒng)，不論您選擇什么機型，大多數(shù)系統(tǒng)都內(nèi)置有豐富的人性化功能，可以使您收益匪淺。

　　原文提到的掃描速度并沒有標(biāo)注對應(yīng)的掃描分辨率，僅供參考，具體數(shù)據(jù)請查閱相應(yīng)產(chǎn)品資料。

　　現(xiàn)在，共聚焦顯微鏡正不斷向更快速、更靈敏、更高分辨率及更好的可擴展性發(fā)展，不斷有新技術(shù)誕生。速度方面，有共振快速掃描頭及轉(zhuǎn)盤共聚焦;靈敏度方面有AOBS分光系統(tǒng)及更靈敏的檢測器（HyD，GaAsp PMT）;分辨率方面有超高分辨率（SIM，STED， PALM，STORM）;此外還有多光子、白激光、SMD等技術(shù)。我們在選擇共聚焦系統(tǒng)時能多聽聽各廠家的介紹，以便對這些技術(shù)有所了解，根據(jù)自己可能進行的研究選擇zui合適的儀器。