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質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)的方法原理以及實(shí)驗(yàn)步驟
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)zui主要的DNA載體。 提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步： ①細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增 ②細(xì)菌菌體的裂解 ③質(zhì)粒DNA的純化 |
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| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)zui主要的DNA載體。 提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步： ①細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增 ②細(xì)菌菌體的裂解 ③質(zhì)粒DNA的純化 |
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| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)zui主要的DNA載體。 提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步： ①細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增 ②細(xì)菌菌體的裂解 ③質(zhì)粒DNA的純化 |
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提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：
①細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增
②細(xì)菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
一、材料與試劑準(zhǔn)備
1. 材料：大腸桿菌。
2. 儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺(tái)式離心機(jī)，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測(cè)儀。
3. 試劑：
（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。
（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。
（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。
（4）3 M NaAc PH5.2，高壓滅菌，4℃保存。
（5）異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無水乙醇，70%乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑。
（5）異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無水乙醇，70%乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑。
二、操作步驟
1. 細(xì)菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2 ml/20ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過夜。
2. 離心10 min，5 000 rpm， 4℃；棄上淸液。
3. 沉淀（菌體細(xì)胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
4. 重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。
8. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。
10. 加入40 ul，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14. 電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。
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