百歐博偉生物：細胞培養(yǎng)中，血清（尤其是胎牛血清）是一個極其關鍵但也經(jīng)常帶來問題的成分。以下是圍繞血清的常見問題及其解答，希望能幫助你更順利地培養(yǎng)細胞：

一、血清的基礎認知與選擇

1、為什么細胞培養(yǎng)需要血清？

提供生長因子和激素：刺激細胞增殖和維持細胞功能。

提供結(jié)合蛋白：如轉(zhuǎn)鐵蛋白（運輸鐵）、白蛋白（運輸脂質(zhì)、激素、維生素，維持滲透壓）、脂蛋白（運輸脂質(zhì)）。

提供貼壁因子：如纖連蛋白、層粘連蛋白，幫助貼壁細胞附著于培養(yǎng)表面。

提供營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、葡萄糖、維生素、微量元素等。

提供蛋白酶抑制劑：保護細胞免受自身或培養(yǎng)基中蛋白酶的損傷。

提供緩沖能力：與碳酸氫鈉系統(tǒng)協(xié)同作用，維持培養(yǎng)基pH值穩(wěn)定。

提供物理保護：減少培養(yǎng)過程中的機械損傷（如攪拌、吹打）。

2、胎牛血清、新生牛血清、馬血清... 有什么區(qū)別？如何選擇？

胎牛血清：取自胎牛心臟穿刺，未接觸外界環(huán)境，成分最復雜、生長因子含量、免疫球蛋白含量，適用于絕大多數(shù)細胞類型，尤其是嬌貴、難養(yǎng)的細胞（如干細胞、原代細胞）。

新生牛血清：取自出生后10-14天內(nèi)的小牛。生長因子含量較FBS低，免疫球蛋白含量較高。適用于一些較易培養(yǎng)的細胞系，成本較低。

馬血清：常用于某些特定細胞類型，如骨髓基質(zhì)細胞、某些神經(jīng)元細胞。成分與牛血清不同。

其他血清：如人血清（用于某些特定的人源細胞研究）、山羊血清、豬血清等，應用更局限。

選擇原則：

細胞類型要求：查閱文獻或ATCC等細胞庫的建議。

實驗目的：基礎培養(yǎng)、增殖、維持、分化、生產(chǎn)生物制品（對血清成分要求更嚴格）等。

批次差異：所有血清都存在批次差異，選擇信譽好的供應商并提前測試是關鍵。

3、什么是“優(yōu)級”、“特級”血清？如何判斷血清質(zhì)量？

這些是供應商根據(jù)其內(nèi)部質(zhì)量控制標準（如內(nèi)毒素水平、血紅蛋白含量、總蛋白含量、促生長能力測試、微生物檢測等）劃分的等級。“優(yōu)級”、“特級”通常意味著更低的雜質(zhì)含量（如內(nèi)毒素<10 EU/ml，血紅蛋白<20mg/dl）和更高的促生長能力。

判斷質(zhì)量的核心：最終還是要靠你自己的細胞來做生長測試！供應商提供的數(shù)據(jù)是基礎，但不同細胞對血清的需求和敏感性差異很大。

二、血清的使用與處理

1、血清如何保存？

長期儲存：-20°C 或更低（如 -80°C）。避免反復凍融！這是最重要的原則之一。

解凍后短期儲存：解凍后，如果無菌操作分裝，可以在 2-8°C (冰箱) 保存最多幾周（通常建議1個月以內(nèi)）。但應盡快用完，并密切觀察是否渾濁或沉淀增多。強烈建議分裝凍存！

禁止：長期在4°C保存未開封血清（瓶內(nèi)可能緩慢結(jié)冰導致沉淀增多）；反復凍融；在37°C水浴中長時間放置。

2、血清如何正確解凍？

推薦方法：將凍存的血清瓶（或分裝管）置于 4°C冰箱過夜緩慢解凍。這是最溫和的方法，能減少沉淀形成和蛋白變性。

次選方法（需謹慎）：如果需要快速解凍，可將血清瓶放入37°C水浴中，輕輕、間歇性地搖動，一旦融化立即取出。避免長時間高溫水浴（>30分鐘），這會加速沉淀形成和成分降解。確保水浴鍋清潔，瓶口在水面以上防止污染。

避免：室溫解凍（速度慢，易污染）；微波爐解凍（受熱不均，破壞成分）。

3、血清中出現(xiàn)沉淀/絮狀物是什么？怎么辦？

原因：

纖維蛋白原/纖維蛋白：是血液凝固過程中的成分，解凍后或4°C儲存時易析出。通常對細胞無害。

磷酸鈣結(jié)晶：在pH值偏堿或含有高濃度鈣鎂的培養(yǎng)基中易形成。

脂蛋白/脂質(zhì)聚集：在低溫或反復凍融后易出現(xiàn)。

其他蛋白沉淀。

處理：

輕微的沉淀（絮狀、細小顆粒）通常無需處理，可以直接使用，或者在無菌條件下離心（如400g, 5-10分鐘）后取上清加入培養(yǎng)基。離心是推薦做法。

避免劇烈搖晃或過濾（除非沉淀非常多且影響觀察），過濾可能去除部分有益成分。

如果沉淀量巨大、顏色異常（如紅色、渾濁）或伴隨pH變化，則可能代表污染或變質(zhì)，應丟棄。

預防：避免反復凍融；解凍后4°C保存時間不宜過長；分裝凍存；解凍時避免高溫和劇烈搖晃。

4、血清需要過濾除菌嗎？

購買的商品化血清在出廠前都已經(jīng)過嚴格的三級過濾（0.1µm或更小孔徑），確保無菌。用戶通常不需要自行過濾。

例外：

在操作過程中被懷疑污染。

使用非商品化的自制血清。

需要去除特定沉淀物（但需權衡損失有效成分的風險）。

5、血清需要熱滅活嗎？什么時候需要？

熱滅活：將血清在56°C水浴中孵育30分鐘，然后迅速冷卻。目的是滅活補體系統(tǒng)（參與免疫反應的蛋白）和一些不穩(wěn)定酶（如磷脂酶）。

需要熱滅活的情況：

培養(yǎng)免疫細胞：如淋巴細胞、巨噬細胞，避免補體介導的細胞毒性。

進行某些基于補體的實驗：如病毒中和實驗、免疫細胞殺傷實驗。

特定細胞類型要求：有些胚胎干細胞或雜交瘤細胞的培養(yǎng)方案建議使用熱滅活血清。

懷疑血清中含有對細胞有害的不穩(wěn)定成分。

不需要熱滅活的情況（大多數(shù)）：

絕大多數(shù)常規(guī)細胞系培養(yǎng)。

熱滅活會損失部分生長因子、維生素、氨基酸，并增加沉淀形成。

建議：除非明確要求，否則不要熱滅活血清。如果必須滅活，嚴格控溫控時，滅活后立即使用或分裝凍存。

6、血清在培養(yǎng)基中的濃度應該是多少？

沒有固定答案！取決于細胞類型、實驗目的、基礎培養(yǎng)基成分。

常見范圍：

標準培養(yǎng)：5% - 20%。10%是的起始濃度。

維持/低代謝狀態(tài)：可降至1%-5%。

特殊細胞（如干細胞、原代細胞）：可能需要10%-20%甚至更高。

無血清培養(yǎng)：0%，需添加特定的補充因子。

確定方法：

查閱文獻或細胞來源信息。

進行生長曲線測試：在相同條件下，測試不同濃度血清（如0%, 2%, 5%, 10%, 15%）對細胞增殖的影響，選擇既能滿足生長需求又經(jīng)濟（且減少批次效應影響）的濃度。

三、血清相關問題與解決方案

1、細胞狀態(tài)不好（生長慢、形態(tài)改變、死亡），懷疑是血清問題，怎么辦？

排查步驟：

確認污染：顯微鏡觀察（細菌、真菌、支原體）、培養(yǎng)基渾濁度、pH異常變化。

檢查培養(yǎng)條件：CO2濃度、溫度、濕度是否正確？培養(yǎng)基是否新鮮配制？pH是否正確？消化過程是否過久或劇烈？

回顧操作：是否有更換操作人員或步驟？血清是否是新批次？批次差異是血清見的問題根源！

血清批次測試：這是關鍵！

保留一些已知表現(xiàn)良好的舊批次血清。

用新批次血清和舊批次血清（作為對照）同時培養(yǎng)同一種細胞（相同的代次、密度、條件）。

比較細胞的貼壁效率、增殖速度、形態(tài)、存活率等。

如果新批次表現(xiàn)顯著差于舊批次，則很可能是血清問題。

解決方案：

聯(lián)系供應商，提供測試數(shù)據(jù)和細胞類型信息，詢問是否可以更換批次或獲得樣品測試。

如果可能，提前測試多個批次，選定表現(xiàn)批次并大量購買同一批次備用。

考慮無血清培養(yǎng)基或化學成分限定培養(yǎng)基。

2、血清批次差異為什么這么大？如何應對？

原因：血清是天然產(chǎn)物，其成分受牛只年齡、品種、地理位置、飲食、季節(jié)、采血方式、加工處理工藝等多種因素影響。無法做到像化學試劑那樣的均一性。

應對策略：

提前測試：在購買大批量前，務必要求供應商提供多個批次的免費樣品進行測試。選擇你細胞的批次。

大批量采購：一旦選定一個表現(xiàn)良好的批次，盡可能一次性購買足夠長時間（如1-2年）實驗所需的量，避免頻繁更換批次。

嚴格記錄：詳細記錄使用的血清品牌、貨號、批號。更換批次時務必做好標識和對比測試。

供應商管理：選擇信譽好、質(zhì)量穩(wěn)定、提供批次檢測報告、支持樣品測試和問題血清更換的供應商。

考慮替代方案：對于關鍵實驗或?qū)ρ迕舾卸鹊募毎?，積極探索無血清培養(yǎng)基或化學成分限定培養(yǎng)基。

3、血清可以替代嗎？無血清培養(yǎng)是什么？

血清替代物：是一些人工配制的混合物，旨在模擬血清的部分功能（如提供生長因子、激素、貼壁因子、載體蛋白）。它們可以部分或替代血清，減少但不能消除批次差異。

無血清培養(yǎng)基： 不添加血清或血清替代物，而是添加精確濃度的必需營養(yǎng)成分（氨基酸、維生素、微量元素）、特定的生長因子、激素、結(jié)合蛋白（如重組人白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白）、脂質(zhì)、貼壁因子等。目標是提供細胞生長所需的一切，排除未知成分的干擾。

優(yōu)點：

成分明確，批次間一致性高。

減少動物源成分帶來的病毒、支原體等污染風險。

避免血清中不明因子對實驗結(jié)果的干擾（如信號通路研究、蛋白/抗體生產(chǎn)、細胞治療）。

符合細胞治療、生物制品生產(chǎn)的嚴格法規(guī)要求（減少外源因子）。

缺點/挑戰(zhàn)：

需要針對特定細胞類型進行優(yōu)化和驗證，通用性不如含血清培養(yǎng)基。

開發(fā)和優(yōu)化成本高。

轉(zhuǎn)換過程可能需要時間適應，細胞可能需要“馴化”。

成本可能高于含血清培養(yǎng)基（尤其是商業(yè)化的專用配方）。

是否轉(zhuǎn)換：取決于實驗目的、細胞類型、對一致性和純度的要求以及預算。

四、血清的質(zhì)量控制

如何檢測新批次血清的質(zhì)量？

供應商提供的COA：查看供應商的檢測報告，關注內(nèi)毒素（<10 EU/ml，越低越好）、血紅蛋白（<20 mg/dl）、總蛋白含量（通常在30-45 mg/ml）、無菌檢測（細菌、真菌、支原體）、病毒檢測等指標。

關鍵：自行進行細胞生長測試：

克隆形成率：測試低密度接種下細胞形成克隆的能力。

細胞倍增時間：測定在含該血清的培養(yǎng)基中細胞的增殖速度。

細胞貼壁效率：觀察細胞接種后的貼壁速度和狀態(tài)。

細胞形態(tài)：顯微鏡下觀察細胞形態(tài)是否健康、典型。

細胞活力：臺盼藍染色等檢測細胞死亡率。

特定功能測試：如果細胞有特殊功能（如分泌某種因子、分化能力），測試該功能是否正常。

與已知良好批次對比：這是的方法。

總結(jié)與關鍵建議：

批次差異是血清使用的挑戰(zhàn)！務必提前測試多個批次，選定后大批量采購同一批次。

嚴格記錄血清信息（品牌、貨號、批號）。

正確保存（-20°C或更低，避免反復凍融，解凍后4°C短期保存） 和解凍（推薦4°C過夜）。

謹慎對待熱滅活，除非實驗明確要求。

沉淀很常見，輕微沉淀離心去除即可，大量異常沉淀或變色則丟棄。

細胞狀態(tài)不好時，系統(tǒng)排查，血清批次是首要懷疑對象。

對于高要求實驗（如生產(chǎn)、治療、機制研究），積極考慮無血清培養(yǎng)基或化學成分限定培養(yǎng)基。

選擇和使用血清需要經(jīng)驗和細心。養(yǎng)成良好的記錄習慣，建立標準的測試流程，與可靠的供應商合作，是減少血清相關問題、保障細胞培養(yǎng)成功的關鍵。

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