文章來(lái)源公眾號(hào)：一毛的生命科學(xué)      作者：科研不過(guò)名利場(chǎng)

一個(gè)人很容易受制于先前的固定經(jīng)驗(yàn)，比如我之前做異體CAR的，相比于自體CAR細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是患者的免疫細(xì)胞比如T細(xì)胞不好使，沒(méi)有健康的人細(xì)胞牛，所以當(dāng)看到體內(nèi)制備火熱的時(shí)候（各種公眾號(hào)都在發(fā)，很容易隨機(jī)刷到），所以腦海里第一個(gè)問(wèn)題就是患者的T細(xì)胞不好使是做異體CAR的其中一個(gè)優(yōu)勢(shì)，到體內(nèi)CAR制備就好使了？所以下面來(lái)了解一下體內(nèi)制備，做個(gè)知識(shí)補(bǔ)充。

1. 體內(nèi) CAR-T 的原理及傳統(tǒng) CAR-T 的區(qū)別

傳統(tǒng) CAR-T 制備（自體/異體）：目前已上市的 CAR-T 療法大多采用自體模式，即從患者自身采集 T 細(xì)胞，經(jīng)體外基因改造使其表達(dá)嵌合抗原受體（CAR），大量擴(kuò)增后再回輸體內(nèi)。這一過(guò)程通常需要數(shù)周時(shí)間和高昂成本（每例可能40萬(wàn)美元以上）。自體CAR-T的生產(chǎn)流程復(fù)雜（包括淋巴細(xì)胞分離、體外激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增培養(yǎng)、制劑質(zhì)檢等多個(gè)步驟）。同時(shí)，由于每名患者需定制，其物流和保存也具有挑戰(zhàn)。異體CAR-T則嘗試用健康供者的T細(xì)胞批量生產(chǎn)“現(xiàn)貨”產(chǎn)品，以降低成本并提高可及性。異體CAR-T有望提供即取即用的細(xì)胞制品，但存在免疫相容性問(wèn)題：供者T細(xì)胞的 TCR 可能攻擊患者組織引發(fā)移植物抗宿主病 (GvHD)，反之患者免疫系統(tǒng)也可能清除外源CAR-T（宿主抗移植物反應(yīng)），導(dǎo)致療效下降。

體內(nèi) CAR-T 原理：體內(nèi)CAR-T療法的思路是直接在患者體內(nèi)將其T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AR-T細(xì)胞，無(wú)需體外培養(yǎng)擴(kuò)增。具體做法是將編碼CAR結(jié)構(gòu)的基因載體（如病毒載體或基因納米顆粒）直接經(jīng)靜脈或局部注射給患者，使這些載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)患者自身的T淋巴細(xì)胞，從而讓T細(xì)胞原位表達(dá)CAR受體。這樣，患者體內(nèi)的T細(xì)胞在體內(nèi)被重編程為CAR-T并增殖發(fā)揮抗腫瘤作用。該方法跳過(guò)了繁瑣的體外步驟，大大縮短治療準(zhǔn)備時(shí)間，理論上可實(shí)現(xiàn)“當(dāng)天給藥，當(dāng)天體內(nèi)生成CAR-T”。正如文獻(xiàn)指出的，直接體內(nèi)工程化T細(xì)胞可以wan全免除體外操作和擴(kuò)增過(guò)程，將治療細(xì)胞直接在體內(nèi)生成。由于避免了個(gè)性化的體外制造流程，體內(nèi)CAR-T有希望降低成本并提高可及性。而且，體內(nèi)產(chǎn)生CAR-T可能減少某些系統(tǒng)性副作用，例如由于不需要大量回輸活化細(xì)胞，細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性等發(fā)生率或嚴(yán)重程度可能降低。此外，體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)利用的是患者自身細(xì)胞，因此和自體CAR-T一樣不存在GVHD風(fēng)險(xiǎn)，也避免了患者對(duì)異體細(xì)胞的免疫排斥問(wèn)題。

總之，體內(nèi)CAR-T與傳統(tǒng)CAR-T的核心區(qū)別在于制造方式：前者將基因療法直接用于患者，使患者體內(nèi)完成CAR-T的“生產(chǎn)”和擴(kuò)增，而后者需要實(shí)驗(yàn)室中完成細(xì)胞改造和擴(kuò)增再回輸。這使得體內(nèi)CAR-T有望成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的“即用型”療法，節(jié)省時(shí)間和成本。同時(shí)，繞過(guò)了多輪體外刺激擴(kuò)增，體內(nèi)生成的CAR-T細(xì)胞可能避免過(guò)度分化和疲竭，保留更原始的功能表型。這一點(diǎn)在后文將詳述。

2. 體內(nèi) CAR-T 的遞送系統(tǒng)及對(duì) T 細(xì)胞亞群的靶向

實(shí)現(xiàn)體內(nèi)CAR-T的關(guān)鍵在于高效安全地將CAR基因遞送給體內(nèi)的T細(xì)胞。目前主要有兩大類(lèi)載體系統(tǒng)：病毒載體和非病毒納米載體，包括脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等。不同系統(tǒng)在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和對(duì)T細(xì)胞亞群的選擇性各有特點(diǎn)。

• 病毒載體：AAV 和慢病毒。重組腺相關(guān)病毒（AAV）因不整合基因組、可在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)而被認(rèn)為是較安全的體內(nèi)基因治療載體。已有研究利用AAV載入CAR基因直接注射，小鼠實(shí)驗(yàn)中觀察到免疫細(xì)胞被體內(nèi)重編程表達(dá)CAR并導(dǎo)致腫瘤消退。不過(guò)AAV天然并不特異感染T細(xì)胞，在體內(nèi)可能主要感染肝臟等組織；如何提高其對(duì)T細(xì)胞的靶向性是挑戰(zhàn)。另外，慢病毒（LV）載體可插入較大基因并穩(wěn)定整合，已廣泛用于體外CAR-T制備。用于體內(nèi)時(shí)，慢病毒的廣譜嗜性需要調(diào)整。研究者開(kāi)發(fā)了靶向T細(xì)胞的慢病毒包膜：例如在病毒表面融合抗體或scFv，使其只感染T細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)在慢病毒包膜上結(jié)合抗-CD8的單鏈抗體并假型化病毒，能在小鼠體內(nèi)選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞并生成CAR-T，隨后在人源化小鼠中觀察到B細(xì)胞被清除以及類(lèi)似CRS的現(xiàn)象。這一結(jié)果證明了靶向慢病毒可直接在體內(nèi)產(chǎn)生功能性CAR-T。此外，研究還開(kāi)發(fā)了針對(duì)CD4或CD8受體的慢病毒載體，可實(shí)現(xiàn)對(duì)人源T細(xì)胞高效且特異的基因轉(zhuǎn)移，將CAR基因幾乎只導(dǎo)入目標(biāo)T細(xì)胞亞群。通過(guò)這些受體定向的病毒載體，體內(nèi)遞送的特異性和效率大大提高，有望避免非T細(xì)胞受到感染。

• 非病毒載體：納米顆粒（聚合物納米粒、LNP等）。出于安全性和成本考慮，許多研究轉(zhuǎn)向非病毒的基因遞送策略。其中陽(yáng)離子聚合物納米顆粒和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是常用載體。早期一項(xiàng)研究shou次嘗試了體內(nèi)將核酸遞送至T細(xì)胞：Smith等人使用帶正電的聚(β-氨基酯)聚合物納米顆粒包裹CAR質(zhì)粒DNA，靜脈注射小鼠后，觀察到T細(xì)胞被體內(nèi)編程為抗白血病的CAR-T。后續(xù)研究改用攜帶CAR mRNA的類(lèi)似聚合物納米顆粒，多次靜脈給藥能夠在體內(nèi)持續(xù)地產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞，在人源性小鼠模型中對(duì)白血病、前列腺癌和乙肝相關(guān)肝癌等產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤效應(yīng)，療效與傳統(tǒng)回輸CAR-T相當(dāng)。這一系列研究驗(yàn)證了聚合物納米載體遞送CAR基因的可行性。

  當(dāng)前應(yīng)用更廣泛的是脂質(zhì)納米顆粒（LNP）技術(shù)。LNP由離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔脂質(zhì)、PEG修飾脂質(zhì)和膽固醇等組成，可高效包裹并遞送信使RNA（mRNA）。將CAR編碼mRNA用LNP包裝，可在T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)CAR而無(wú)基因組整合風(fēng)險(xiǎn)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，離子化LNP轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的CAR表達(dá)效率和殺瘤活性與電轉(zhuǎn)染相當(dāng)，但對(duì)細(xì)胞活力的毒性更低。不過(guò)，未經(jīng)修飾的LNP傾向于被肝臟攝取，靜脈注射后大量顆粒進(jìn)入肝細(xì)胞和脾臟巨噬細(xì)胞等。因此，提高LNP在體內(nèi)對(duì)T淋巴細(xì)胞的特異靶向非常重要。幸運(yùn)的是，納米粒表面可以通過(guò)化學(xué)修飾增加靶向配體，例如連接針對(duì)T細(xì)胞表面分子的抗體或配體，使LNP選擇性結(jié)合并進(jìn)入T細(xì)胞。這種靶向LNP（tLNP）策略已在研究中取得進(jìn)展：有報(bào)道顯示，加載CAR mRNA的CD5靶向LNP在小鼠體內(nèi)能夠使循環(huán)T淋巴細(xì)胞高效表達(dá)CAR，并成功清除心臟纖維化模型中的致病成纖維細(xì)胞。最新發(fā)表的研究進(jìn)一步證實(shí)了靶向特定T細(xì)胞亞群的 LNP的效果：例如，將抗體修飾的LNP專(zhuān)門(mén)遞送至CD8^+ T細(xì)胞，可在體內(nèi)將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AR-T。在人源化小鼠腫瘤模型中，此舉顯著控制了腫瘤生長(zhǎng)；在食蟹猴模型中，給藥后也觀察到了B細(xì)胞被清除的反應(yīng)。由此可見(jiàn)，精確定向的基因納米載體能夠在體內(nèi)高效重編程特定亞群T細(xì)胞為CAR-T，實(shí)現(xiàn)預(yù)期的免疫殺傷功能。

綜上，目前體內(nèi)CAR-T的遞送載體包括AAV、慢病毒等病毒系統(tǒng)和聚合物納米粒、LNP等非病毒系統(tǒng)。提升對(duì)T細(xì)胞的靶向效率是所有系統(tǒng)面臨的共同挑戰(zhàn)和研發(fā)重點(diǎn)。靶向手段包括修改病毒衣殼/包膜的受體嗜性，以及在納米顆粒表面附著抗體或配體。這些改進(jìn)已使體內(nèi)遞送在動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)了對(duì)T細(xì)胞特異的高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)。隨著技術(shù)進(jìn)步，我們有望在人體內(nèi)也實(shí)現(xiàn)安全、高效且可重復(fù)的CAR基因遞送，使患者自身T細(xì)胞在體內(nèi)被選擇性改造成抗腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞。

3. 體內(nèi) CAR-T 在實(shí)體瘤中的研究進(jìn)展

雖然CAR-T細(xì)胞在血液腫瘤中取得了突破性成功，但在實(shí)體瘤中的應(yīng)用仍面臨諸多困難。不過(guò)，體內(nèi)CAR-T療法為攻克實(shí)體瘤帶來(lái)了一些新的希望。近年來(lái)，一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和早期臨床探索顯示出體內(nèi)CAR-T在實(shí)體瘤模型中的可行性和療效：

• 動(dòng)物模型研究：多項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證體內(nèi)CAR-T可對(duì)實(shí)體瘤產(chǎn)生抗腫瘤作用。其中，Parayath等人的研究利用聚合物納米顆粒反復(fù)靜脈注射，將編碼前列腺特異抗原和肝癌相關(guān)抗原的CAR基因遞送至T細(xì)胞，成功在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞，對(duì)人源前列腺癌和HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌異種移植瘤實(shí)現(xiàn)了顯著的抑制和消退，療效與傳統(tǒng)體外制備的CAR-T相當(dāng)。另一項(xiàng)研究中，Zhou等設(shè)計(jì)了LNP同時(shí)遞送IL-6的shRNA和抗CD19 CAR基因，在急性淋巴白血病的小鼠模型中，同樣觀察到體內(nèi)產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞清除了腫瘤負(fù)荷，效果可比擬輸注CAR-T。針對(duì)實(shí)體瘤抗原的探索也在進(jìn)行：有研究報(bào)道將編碼抗人間皮瘤抗原（比如間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的靶標(biāo)）的CAR mRNA裝載入靶向性納米顆粒，給予腫瘤荷瘤小鼠后體內(nèi)生成的CAR-T細(xì)胞使腫瘤生長(zhǎng)受到控制。此外，利用AAV病毒直接在體內(nèi)制造CAR-T細(xì)胞也有初步成功：Nawaz等人將攜帶CAR基因的AAV注入腫瘤小鼠，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)CAR，結(jié)果觀察到腫瘤明顯縮小。這些前臨床結(jié)果證明，無(wú)論是病毒載體還是納米載體，均可用于在活體內(nèi)產(chǎn)生功能性CAR-T細(xì)胞并對(duì)實(shí)體瘤實(shí)施打擊。

• 臨床研究進(jìn)展：體內(nèi)CAR-T療法正從動(dòng)物走向臨床。2023年以來(lái)，已有公司啟動(dòng)了相關(guān)的人體試驗(yàn)。例如，Myeloid Therapeutics公司宣布開(kāi)展shou例基于體內(nèi)CAR的mRNA療法臨床試驗(yàn)，將合成mRNA（LNP封裝）注射到患者體內(nèi)，以使循環(huán)免疫細(xì)胞表達(dá)靶向TROP2的CAR，用于實(shí)體瘤治療。這是針對(duì)上皮來(lái)源實(shí)體瘤的一種創(chuàng)新療法。同一公司還推動(dòng)了一種靶向GPC3（常見(jiàn)于肝細(xì)胞癌等）的體內(nèi)CAR程序進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。需要指出的是，這些療法有的并非將CAR基因送入T細(xì)胞，而是體內(nèi)重編程患者的先天免疫細(xì)胞（如單核/髓系細(xì)胞）表達(dá)CAR。例如，Myeloid Therapeutics的方案旨在讓髓系細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)抗TROP2 CAR，以發(fā)揮抗實(shí)體瘤作用。這種策略被稱(chēng)為體內(nèi)CAR-巨噬細(xì)胞（CAR-M）的概念。然而，無(wú)論作用細(xì)胞類(lèi)型如何，其核心都是通過(guò)體內(nèi)遞送基因來(lái)賦予患者自身免疫細(xì)胞以抗腫瘤的特異性。除了公司主導(dǎo)的臨床試驗(yàn)，一些學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)也在探索體內(nèi)CAR-T在人類(lèi)中的應(yīng)用策略。目前已有報(bào)告的人體病例顯示，體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞能夠在非人靈長(zhǎng)類(lèi)體內(nèi)造成預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)（如B細(xì)胞清除），為后續(xù)在人類(lèi)的安全性和有效性研究奠定了基礎(chǔ)。盡管截至目前針對(duì)實(shí)體瘤的體內(nèi)CAR-T在臨床上仍處于早期, 這些積極的進(jìn)展暗示了其潛力：在未來(lái)，患者或許只需注射一支基因載體制劑，即可在體內(nèi)產(chǎn)生可以攻擊實(shí)體腫瘤的CAR-T細(xì)胞。

值得一提的是，體內(nèi)CAR技術(shù)的拓展還包括在體內(nèi)改造其它免疫細(xì)胞（如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）用于腫瘤免疫治療。這些變體可能在實(shí)體瘤中發(fā)揮du特優(yōu)勢(shì)（例如CAR-巨噬細(xì)胞更易浸潤(rùn)腫瘤并吞噬腫瘤細(xì)胞）。雖然本篇聚焦CAR-T，但這些探索體現(xiàn)了體內(nèi)CAR療法的廣泛應(yīng)用前景。

4. 體內(nèi) CAR-T 療效顯著的可能原因

體內(nèi)CAR-T療法在一些研究中表現(xiàn)出令人鼓舞的效果，甚至在患者自身T細(xì)胞質(zhì)量欠佳的情況下也取得療效。那么，**為何體內(nèi)制備的CAR-T細(xì)胞仍能發(fā)揮良好作用？**可能的原因包括以下幾個(gè)方面：

• 原位轉(zhuǎn)染激活和漸進(jìn)增殖：在體內(nèi)直接將CAR基因引入T細(xì)胞，本身可能對(duì)T細(xì)胞起到一定激活作用。例如，某些基因載體（如LNP的RNA分子）能觸發(fā)先天免疫感應(yīng)，使T細(xì)胞進(jìn)入警覺(jué)狀態(tài)。此外，與體外流程需要強(qiáng)烈刺激T細(xì)胞不同，體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)后T細(xì)胞的擴(kuò)增是在機(jī)體環(huán)境中逐步進(jìn)行的。腫瘤相關(guān)抗原的持續(xù)存在將不斷驅(qū)動(dòng)CAR-T細(xì)胞增殖，但這種增殖相對(duì)溫和而非一次性大量擴(kuò)增，有利于避免細(xì)胞過(guò)度分化和衰竭。文獻(xiàn)指出，體外反復(fù)刺激和擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致CAR-T功能耗竭，而體內(nèi)原位重編程的T細(xì)胞則未經(jīng)過(guò)度操縱，且以更漸進(jìn)的動(dòng)力學(xué)增殖，或能克服傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞的功能衰減。因此，體內(nèi)產(chǎn)生的CAR-T可能保持更長(zhǎng)的增殖活性和存續(xù)期，從而在患者體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮療效。

• 優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)有利的T細(xì)胞亞群：體內(nèi)基因遞送往往并非平均地轉(zhuǎn)導(dǎo)所有T細(xì)胞，可能在無(wú)意中偏重于某些亞群。理想情況下，若載體更易感染初始/早期記憶T細(xì)胞，則生成的CAR-T具有更強(qiáng)的增殖力和持久性。研究表明，較幼稚的記憶表型T細(xì)胞（如干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞 TSCM、中央記憶T細(xì)胞 TCM）能提供zhuo越的增殖和抗腫瘤能力，并持久存活，而終末分化效應(yīng)T細(xì)胞則效果較弱。體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能偏向于這些未分化wan全的T細(xì)胞：例如，靜脈注射的載體容易接觸循環(huán)中的na?ve T細(xì)胞和中央記憶T細(xì)胞，而嚴(yán)重耗竭的效應(yīng)T細(xì)胞往往存在于腫瘤組織中且數(shù)量有限。因此，即便患者外周T細(xì)胞總體功能欠佳，只要有少量健康的記憶T細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)成為CAR-T，它們就有潛力大量擴(kuò)增并發(fā)揮效應(yīng)。此外，如果通過(guò)特殊途徑（例如局部腫瘤內(nèi)注射載體），還能直接轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤浸潤(rùn)性的駐留記憶T細(xì)胞（TRM）。這些細(xì)胞原本就駐扎于腫瘤微環(huán)境，經(jīng)過(guò)CAR改造后可以就地發(fā)動(dòng)攻擊，無(wú)需克服趨向腫瘤的遷移障礙。這種特定亞群T細(xì)胞的優(yōu)先改造可能解釋了為何體內(nèi)CAR-T在一些模型中表現(xiàn)突出：它有效動(dòng)員了蕞具增殖和存續(xù)潛力的一批T細(xì)胞來(lái)對(duì)抗腫瘤。

• 腫瘤微環(huán)境中的動(dòng)態(tài)激活：體內(nèi)產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境（TME）中逐步活化，這種動(dòng)態(tài)過(guò)程可能有利于療效。一方面，CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)接觸抗原是一個(gè)持續(xù)過(guò)程，不像體外擴(kuò)增后回輸時(shí)所有CAR-T同時(shí)大量涌入、瞬時(shí)高水平激活。相反，體內(nèi)生成的CAR-T隨著表達(dá)CAR受體逐漸開(kāi)始識(shí)別腫瘤抗原，不同時(shí)間有不同亞群細(xì)胞被招募和活化，形成持續(xù)不斷的攻勢(shì)。這種梯度式的激活避免了單次過(guò)猛的免疫反應(yīng)，降低了細(xì)胞因子風(fēng)暴等風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)讓CAR-T細(xì)胞得以長(zhǎng)期輪番作戰(zhàn)。另一方面，在腫瘤環(huán)境中，CAR-T細(xì)胞的激活可能得到額外的共刺激和輔助信號(hào)。例如，腫瘤組織中存在的抗原提呈細(xì)胞(APC)和輔助性T細(xì)胞，可以提供共刺激分子和促存活的細(xì)胞因子。當(dāng)CAR-T在腫瘤部位被抗原刺激時(shí)，這些因素或能同步加強(qiáng)其功能。并且，CAR-T細(xì)胞每次殺傷腫瘤細(xì)胞后，會(huì)釋放炎性因子并造成腫瘤細(xì)胞裂解，這種動(dòng)態(tài)循環(huán)會(huì)逐漸改變腫瘤局部的免疫環(huán)境，使其更有利于免疫攻擊?？傊?，體內(nèi)CAR-T的效果并非一蹴而就，而是在腫瘤環(huán)境中持續(xù)誘導(dǎo)和放大，這種動(dòng)態(tài)過(guò)程可能比體外擴(kuò)增后集中回輸?shù)姆绞礁訁f(xié)調(diào)有效。

• 與機(jī)體免疫微環(huán)境的協(xié)同：由于體內(nèi)CAR-T療法通常不需強(qiáng)預(yù)處理（如不需要大劑量淋巴清除性化療），患者自身的免疫系統(tǒng)在治療時(shí)相對(duì)完整。這意味著，當(dāng)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)，機(jī)體原有的免疫細(xì)胞也可參與協(xié)同作戰(zhàn)。舉例來(lái)說(shuō)，CAR-T細(xì)胞消滅腫瘤后釋放的腫瘤抗原碎片，可被患者體內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞等攝取并呈遞給天然的T淋巴細(xì)胞，從而誘導(dǎo)針對(duì)多種腫瘤抗原的二次免疫反應(yīng)（稱(chēng)為表位擴(kuò)展）。這有望動(dòng)員非CAR的內(nèi)源性T細(xì)胞一同攻擊腫瘤，彌補(bǔ)CAR靶向的局限。與此同時(shí)，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF等）會(huì)使腫瘤微環(huán)境由“冷”變“熱”，促進(jìn)腫瘤內(nèi)的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等發(fā)揮抗腫瘤活性，并提高腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫攻擊的易感性。例如，IFN-γ可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞提高M(jìn)HC分子表達(dá)，使殘余腫瘤更容易被常規(guī)T細(xì)胞識(shí)別清除。這種免疫協(xié)同效應(yīng)可能使體內(nèi)CAR-T治療獲得比單獨(dú)細(xì)胞作用更大的效果。另外，有研究在體內(nèi)CAR載體中融入了免疫調(diào)節(jié)分子（如IL-12、IL-15等）的表達(dá)，以改善腫瘤微環(huán)境，從而增強(qiáng)CAR-T功能。這些設(shè)計(jì)都體現(xiàn)了體內(nèi)CAR-T可以結(jié)合機(jī)體原有免疫機(jī)制，達(dá)到1+1>2的治療效果。

綜上所述，體內(nèi)CAR-T之所以在某些情況下療效突出，可能歸功于：其產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞質(zhì)地更佳（未過(guò)度耗竭、富含記憶亞群）、激活方式更自然（體內(nèi)逐步擴(kuò)增、與微環(huán)境相互作用）、以及與患者自身免疫系統(tǒng)相輔相成共同對(duì)抗腫瘤。這些因素彌補(bǔ)了患者本底T細(xì)胞功能不佳的不足，使得即便起始T細(xì)胞數(shù)量或質(zhì)量有限，仍能夠以小博大地誘發(fā)強(qiáng)勁的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

5. 體內(nèi) CAR-T 面臨的挑戰(zhàn)與未來(lái)展望

盡管體內(nèi)CAR-T療法展現(xiàn)了諸多優(yōu)點(diǎn)和潛力，但要真正應(yīng)用于臨床、特別是實(shí)體瘤治療，還需克服一系列挑戰(zhàn)，并在未來(lái)發(fā)展中不斷完善：

• 特異性遞送與安全性：如何確保CAR基因只送達(dá)目標(biāo)T細(xì)胞而不誤導(dǎo)至其他細(xì)胞，是首要挑戰(zhàn)之一。若載體將CAR基因整合進(jìn)了非效應(yīng)性的免疫細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)，可能削弱抗腫瘤效果；更嚴(yán)重的是，載體絕不能轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞本身，否則腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)CAR后會(huì)與自身抗原結(jié)合，形成“wei裝”，逃避免疫識(shí)別。文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)在傳統(tǒng)CAR-T治療中，有極少數(shù)白血病腫瘤細(xì)胞意外整合了CAR序列，結(jié)果導(dǎo)致該克隆對(duì)CAR-T療法耐受。為此，未來(lái)載體設(shè)計(jì)必須極大提高對(duì)T細(xì)胞的選擇性。目前的解決方案包括：在載體上附加T細(xì)胞靶向配體（提高100倍以上的T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)選擇性）、采用只能在T細(xì)胞內(nèi)活化的轉(zhuǎn)基因元件（如利用T細(xì)胞特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CAR表達(dá)），以及區(qū)域給藥（如腫瘤局部注射以限制作用范圍）等。此外，病毒載體（如慢病毒）因?yàn)?/span>基因組整合可能引發(fā)插入突變和腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。雖然CAR-T細(xì)胞體內(nèi)長(zhǎng)期存活需要CAR基因長(zhǎng)久表達(dá)，但如何在持久療效和基因安全之間取得平衡是重要課題。一種設(shè)想是在載體中加入安全開(kāi)關(guān)基因，如zi殺開(kāi)關(guān)（iCasp9等）或者藥物調(diào)控開(kāi)關(guān)，一旦CAR-T引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)，可通過(guò)給藥觸發(fā)CAR-T的凋亡或功能抑制?？傊磥?lái)需要更精巧的基因工程手段來(lái)提升遞送特異性并添加安全保險(xiǎn)，保障體內(nèi)CAR-T療法的可控性。

• 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與劑量控制：在人體內(nèi)有效地產(chǎn)生足夠數(shù)量的CAR-T細(xì)胞是另一挑戰(zhàn)。相較于小鼠模型，人類(lèi)患者的T細(xì)胞數(shù)量龐大且分布于血液和組織各處，載體需要足夠劑量和廣泛分布才能轉(zhuǎn)導(dǎo)到足夠數(shù)量的T細(xì)胞。病毒載體如AAV在人體的劑量可能受限于免疫反應(yīng)（患者可能已有抗AAV中和抗體，且重復(fù)給藥會(huì)誘導(dǎo)強(qiáng)免疫反應(yīng)）；非病毒載體如LNP大劑量時(shí)又可能引起一過(guò)性的肝臟毒性或炎癥反應(yīng)。因此，如何優(yōu)化給藥劑量和途徑以實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)但又不引發(fā)毒副作用，需要深入研究。例如，可以探索分次多次給藥策略：非整合載體允許重復(fù)注射，從而逐步累積CAR-T細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)還能根據(jù)患者反應(yīng)動(dòng)態(tài)調(diào)整劑量。反之，如果使用整合型載體一次給藥就取得高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，則需嚴(yán)格控制劑量以免一次產(chǎn)生過(guò)多CAR-T導(dǎo)致嚴(yán)重的CRS等反應(yīng)。未來(lái)的方向可能是在體內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖（比如通過(guò)標(biāo)記或成像技術(shù)），并據(jù)此調(diào)節(jié)后續(xù)劑量，達(dá)到精細(xì)化給藥。

• 腫瘤微環(huán)境的抑制因素：實(shí)體瘤的免疫抑制微環(huán)境仍然是CAR-T療法難以逾越的障礙。體內(nèi)產(chǎn)生的CAR-T雖然就地作戰(zhàn)，但同樣會(huì)受到腫瘤微環(huán)境（TME）中的抑制信號(hào)影響，如腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌的TGF-β、IL-10，表達(dá)的PD-L1、IDO酶等。這些機(jī)制可能使CAR-T功能衰減或耗竭。為此，未來(lái)需要在體內(nèi)CAR-T策略中融入克服TME抑制的設(shè)計(jì)。例如，使用載體共遞送阻斷免疫檢查點(diǎn)的分子（如小干擾RNA抑制PD-1/CTLA-4）或者促炎性細(xì)胞因子基因（如IL-12）來(lái)改造微環(huán)境。也可以考慮將CAR設(shè)計(jì)升級(jí)，如加入能感應(yīng)腫瘤酸性或低氧環(huán)境的元件，使CAR-T在惡劣環(huán)境中仍可高效殺傷。另一方向是聯(lián)合療法：體內(nèi)CAR-T可以與其他藥物聯(lián)用，如檢查點(diǎn)抑制劑、腫瘤壞死因子等，產(chǎn)生協(xié)同作用。另外，正如已有研究開(kāi)始探索的，體內(nèi)CAR-M和CAR-NK細(xì)胞療法可作為CAR-T的補(bǔ)充或替代，在腫瘤內(nèi)發(fā)揮不同機(jī)制的抗腫瘤作用。例如，CAR修飾的巨噬細(xì)胞能夠克服實(shí)體瘤致密基質(zhì)深入腫瘤，并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)；CAR-NK細(xì)胞無(wú)需抗原提呈即可快速殺傷腫瘤。未來(lái)的實(shí)體瘤免疫治療可能是多種體內(nèi)CAR細(xì)胞聯(lián)合，從多角度攻克腫瘤免疫逃逸。

• 患者個(gè)體差異：某些患者（尤其是經(jīng)過(guò)多線治療的晚期腫瘤患者）外周T細(xì)胞數(shù)量極低或功能?chē)?yán)重耗竭，這種情況下體內(nèi)CAR-T療法的效果會(huì)受限。如果患者體內(nèi)幾乎無(wú)可用的T細(xì)胞，“巧婦難為無(wú)米之炊”。對(duì)此，可以在治療前評(píng)估患者的免疫狀況，必要時(shí)通過(guò)細(xì)胞因子（如IL-7、IL-15）提升T細(xì)胞水平，或輸注少量過(guò)繼的T細(xì)胞來(lái)“播種”，然后再進(jìn)行體內(nèi)CAR-T基因遞送。另外，患者已有的抗載體免疫（如抗病毒載體中和抗體、或抗納米顆粒成分的抗體）也可能降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。個(gè)性化地選擇合適的載體類(lèi)型、或者進(jìn)行短期免疫抑制（如使用皮質(zhì)激素或抗CD20清除抗載體抗體）可能成為必要的輔助措施。

• 生產(chǎn)及監(jiān)管：體內(nèi)CAR-T療法兼具基因治療和免疫細(xì)胞治療的屬性，因此在監(jiān)管審批上需要考慮基因制劑的質(zhì)量控制和生物安全。生產(chǎn)方面，大規(guī)模制備高純度、高效價(jià)的病毒載體仍具挑戰(zhàn)；而納米顆粒mRNA制劑雖然生產(chǎn)工藝成熟（得益于mRNA疫苗經(jīng)驗(yàn)），但需要嚴(yán)格的穩(wěn)定性和批間一致性控制。監(jiān)管層面對(duì)這類(lèi)新興療法的安全性審查標(biāo)準(zhǔn)也在探索中，例如需評(píng)估長(zhǎng)效表達(dá)載體的遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)的發(fā)展方向包括：改進(jìn)載體生產(chǎn)工藝以降低成本（例如使用更高效的細(xì)胞工廠產(chǎn)毒系統(tǒng)，或無(wú)細(xì)胞合成mRNA的大規(guī)模流程），建立可靠的質(zhì)控方法來(lái)檢測(cè)載體的活性和純度，以及制定針對(duì)體內(nèi)CAR-T的臨床隨訪指南（如長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)患者是否出現(xiàn)載體相關(guān)的不良事件）。只有在生產(chǎn)和監(jiān)管層面做好充分準(zhǔn)備，體內(nèi)CAR-T才能從實(shí)驗(yàn)階段走向大范圍臨床應(yīng)用。

展望：體內(nèi)CAR-T療法代表著CAR-T技術(shù)發(fā)展的新高度和新方向。它將復(fù)雜的細(xì)胞制備過(guò)程簡(jiǎn)化為“一支注射劑”，有潛力讓更多患者負(fù)擔(dān)得起并及時(shí)用上CAR-T這樣的jian端免疫療法。對(duì)于實(shí)體瘤這種需要全身性和局部兼顧的難題，體內(nèi)CAR-T提供了創(chuàng)新的解法。然而，要充分實(shí)現(xiàn)其潛力，仍需通過(guò)更多臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證安全性和有效性，不斷改進(jìn)技術(shù)以應(yīng)對(duì)上述挑戰(zhàn)。未來(lái)，我們可能會(huì)看到體內(nèi)CAR-T與其它療法相結(jié)合，形成多模態(tài)的癌癥免疫治療方案。隨著對(duì)腫瘤免疫和基因遞送理解的深入，體內(nèi)CAR-T療法有望更精確地定向攻擊實(shí)體瘤，同時(shí)將副作用降至zui低?？偠灾?，體內(nèi)CAR-T正處于從實(shí)驗(yàn)室邁向臨床的關(guān)鍵階段，它有望接過(guò)傳統(tǒng)CAR-T的接力棒，成為攻克實(shí)體腫瘤的新wu器，為患者帶來(lái)更高的生存獲益。