一、背景

微生物基因組改造是通過打斷、缺失或替換基因組上目的基因，達(dá)到研究和利用基因功能和性狀的目的，已成功地在以下種類的微生物中實(shí)現(xiàn)了基因改造：大腸桿菌（實(shí)驗(yàn)室菌株和野生菌株）、沙門氏菌、奇異變形桿菌、阪崎腸桿菌、陰溝腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、乳酸菌、假單胞菌等。微生物基因組改造用于細(xì)菌（大腸桿菌）的基因敲入、敲出和替換。針對(duì)大腸桿菌，金斯瑞開發(fā)出新型的λRed-CRISPR/Cas技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)λRed重組和CRISPR/Cas9方法以實(shí)現(xiàn)的靶基因編輯。細(xì)菌基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用自身的Rec系統(tǒng)對(duì)外源進(jìn)入的DNA進(jìn)行同源重組，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的等位替換。

通過設(shè)計(jì)靶基因的同源融合片段，將其克隆至載體中，載體通過接合輸入到靶細(xì)菌。通過抗生素篩選細(xì)菌基因組靶位點(diǎn)整合有載體的插入突變株。在第二輪反向選擇壓力下，只有細(xì)菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失質(zhì)粒的細(xì)菌才可以存活。最后通過PCR鑒定即可獲得目的基因的缺失突變株。

自然界中的微生物總是通過各種各樣的保護(hù)機(jī)制，使它們能夠與惡劣的環(huán)境及侵襲性核酸共存。許多微生物都能通過基于基因序列特異性的方式抵抗核酸入侵。CRISPR/Cas9即是屬于這種保護(hù)機(jī)制之一。在此背景下，推出CRISPR方法進(jìn)行微生物的基因組改造服務(wù)（包括基因敲除、定點(diǎn)突變、定點(diǎn)插入外源序列等）。相比于傳統(tǒng)的基因敲除方法，該方法速度快；非常便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

CRISPR是家族DNA的內(nèi)發(fā)現(xiàn)的序列的基因組的原核生物，如細(xì)菌和古細(xì)菌。這些序列來源于先前已感染原核生物的病毒的DNA片段，用于在隨后的感染過程中檢測(cè)和破壞類似病毒的DNA。因此，這些序列在原核生物的抗病毒防御系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。Cas9是一種酶，它使用CRISPR序列作為指導(dǎo)來識(shí)別和切割對(duì)于所述CRISPR序列互補(bǔ)的DNA的特定鏈。Cas9酶與CRISPR序列一起形成稱為CRISPR-Cas9的技術(shù)的基礎(chǔ)，其可用于編輯生物體內(nèi)的基因。

二、應(yīng)用

微生物基因組改造可用于發(fā)掘外源蛋白表達(dá)過程中相關(guān)的靶點(diǎn)基因研究：

在谷氨酸棒狀桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的開發(fā)及外源蛋白高效表達(dá)宿主改造的實(shí)驗(yàn)中利用CRISPR/Cas9技術(shù),在C.glutamicum中構(gòu)建了一套高效的基因編輯工具。同時(shí)以C.glutamicum CGMCC1.15647為出發(fā)菌株,通過分析不同溶氧狀態(tài)下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘外源蛋白表達(dá)過程中相關(guān)的靶點(diǎn)基因。在此基礎(chǔ)上,利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)發(fā)掘的優(yōu)化靶點(diǎn)(mepA,porB和clpC)進(jìn)行宿主細(xì)胞改造,改造后的宿主細(xì)胞具有外源蛋白表達(dá)能力提高的特點(diǎn),并成功的利用該優(yōu)化后的宿主實(shí)現(xiàn)了N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)在C.glutamicum中的表達(dá)。

最后還研究了mepA和porB影響外源蛋白表達(dá)的機(jī)理。研究中分別構(gòu)建三個(gè)基因的單敲除及共敲除菌株,并利用GFP和scFv作為模式蛋白來檢測(cè)外源蛋白能力的變化,結(jié)果表明在mepA,porB和clpC三基因敲除菌種中GFP和scFv表達(dá)量相比于野生型菌株都有提高的現(xiàn)象。上述研究結(jié)果為優(yōu)化宿主細(xì)胞提供了新的方法,并成功得到一株能夠更好表達(dá)外源蛋白的C.glutamicum宿主。(C.glutamicum中NT-proBNP蛋白表達(dá)模式組合的確立及表達(dá)。

通過GFP作為模式蛋白在C.glutamicum中構(gòu)建了一套可以快速探究外源蛋白組成型胞內(nèi)表達(dá),誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá),組成型分泌表達(dá),誘導(dǎo)型分泌四種表達(dá)模式組合的方法。利用該系統(tǒng)探究了NT-proBNP蛋白的表達(dá)模式組合,結(jié)果表明NTproBNP在C.glutamicum的表達(dá)模式為組成型胞內(nèi)表達(dá),同時(shí)利用mepA,porB和clpC三基因敲除菌株ΔclpCΔporBΔmepA作為表達(dá)宿主實(shí)現(xiàn)了NT-proBNP在C.glutamicum中的高效表達(dá),產(chǎn)量達(dá)到118.8 mg/g DCW。上述探究外源蛋白表達(dá)模式的方法及NT-proBNP蛋白的成功表達(dá)的實(shí)例為對(duì)應(yīng)用C.glutamicum作為外源蛋白表達(dá)宿主具有借鑒意義。

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