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無細胞蛋白表達：突破傳統(tǒng)瓶頸，解鎖3大高難度蛋白應用場景
膜蛋白結(jié)構(gòu)解析卡在表達階段？
非天然氨基酸標記總失?。?/span>
蛋白表達通量太低？
毒蛋白無法表達？
無細胞蛋白表達技術(shù)正在顛蛋白生產(chǎn)困境，為科研與產(chǎn)業(yè)帶來全新可能。
一、技術(shù)革新：無細胞蛋白表達技術(shù)
無細胞蛋白質(zhì)合成 （CFPS） 系統(tǒng)是一項創(chuàng)新技術(shù)，具有廣泛的潛在應用。在基礎科學和應用科學中，CFPS系統(tǒng)是分子生物學家的重要媒介。與活細胞中的蛋白質(zhì)表達相比，它具有許多優(yōu)勢，并且更頻繁地用于高通量功能基因組學和蛋白質(zhì)組學。在創(chuàng)建核酸可編程蛋白陣列 （NAPPA） 等蛋白質(zhì)陣列或使用顯示技術(shù)創(chuàng)建工程酶時，CFPS 系統(tǒng)非常重要。連接基因型和表型 （表達蛋白的功能） 的主要方法是通過無細胞法。此外，CFPS 系統(tǒng)對于有毒、膜結(jié)合、病毒性且易受細胞內(nèi)蛋白酶介導的快速蛋白水解破壞的蛋白質(zhì)的表達至關(guān)重要。下面將從幾個方面對比CFPS和傳統(tǒng)細胞表達形式。
圖1:反應所需的無細胞蛋白合成 （CFPS） 系統(tǒng)組分的圖示
1.表達階段對比
2.下游處理對比
二、核心應用場景與案例
場景1：全長跨膜蛋白生產(chǎn)——藥物靶點開發(fā)的"鑰匙"
跨膜蛋白 （TMP） 位于不同的膜中，它們在細胞或細胞器的內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間提供門。人類蛋白質(zhì)組中大約 25% 的編碼蛋白包含一個或多個膜區(qū)域。全長跨膜蛋白作為細胞信號傳遞和物質(zhì)交換的核心載體，是目前最主要的藥物靶點，占現(xiàn)階段已知藥物靶點的60%以上。然而，全長膜蛋白難溶于水、易聚集失活，是蛋白表達中的難點。基于細胞表達往往效果不好；采用如VLP等方法時雖然能得到全長膜蛋白，但是不相干雜蛋白干擾過大；采用膜蛋白胞外區(qū)截斷的方法在蛋白性能上的風險有較大隱憂。而無細胞蛋白表達技術(shù)，則可以高成功率、高純度、高活性的表達全長膜蛋白。
珀羅汀生物案例：全長CLDN 18.1膜蛋白可溶表達
實驗人員構(gòu)建了融合標簽的CLDN 18.1質(zhì)粒，選用合適的珀羅汀無細胞表達條件體系，進行表達。通過在無細胞反應體系中加入表面活性劑，實現(xiàn)CLDN 18.1的可溶表達。經(jīng)純化，成功獲得80%以上純度的CLDN 18.1蛋白。下游活性驗證實驗表明，CLDN 18.1蛋白具有良好的生物學活性！
（詳情鏈接：明星膜蛋白CLDN 18.1新合成路線：無細胞系統(tǒng)全長蛋白表達
此外我司基于自主知識產(chǎn)權(quán)的無細胞蛋白表達技術(shù)，已成功表達多種單次、四次、七次全長跨膜蛋白，表達成功率接近100%！
場景2：難度蛋白表達生產(chǎn)—突破蛋白結(jié)構(gòu)研究的“限制”
某些蛋白質(zhì)因其特殊的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，被歸為難表達蛋白，它們不僅是基礎科學的重要課題，更是藥物開發(fā)、結(jié)構(gòu)生物學和生物制造的瓶頸問題。在傳統(tǒng)表達體系中難表達蛋白往往面臨產(chǎn)量低、活性差等問題，它們的表達障礙主要源于三個層面的限制：
1.分子層面，如含有密集二硫鍵網(wǎng)絡或復雜四級結(jié)構(gòu)的蛋白（如抗體Fab片段、多亞基酶復合體），極易在折疊過程中發(fā)生構(gòu)象錯誤，形成無活性的包涵體；
2.細胞層面，疏水性強的跨膜蛋白或依賴特定糖基化修飾的功能蛋白（如GPCRs、凝血因子Ⅶ），難以在普通宿主細胞中維持其天然構(gòu)象；
3.生理層面，具有細胞毒性的蛋白（如溶菌酶）會直接干擾宿主細胞的正常代謝，造成表達系統(tǒng)崩潰。此外，培養(yǎng)環(huán)境的細微變化（如氧化還原電位波動、分子伴侶缺失）都可能引發(fā)蛋白的錯誤加工或降解，進一步降低表達成功率。
珀羅汀生物案例：毒蛋白生產(chǎn)
依托PLD無細胞快速表達技術(shù)，成功表達出BamHI限制性內(nèi)切酶。通過在質(zhì)粒中加入PLD無細胞蛋白表達的BamHI限制性內(nèi)切酶，濃度分別為0、0.001、0.0015、0.015、0.15 ug/uL，37℃酶切1h，驗證酶活性。實驗證明PLD無細胞蛋白表達的BamHI限制性內(nèi)切酶具有活性，低濃度為 0.001 ug/uL即可顯示酶切活性。
詳情鏈接：無細胞蛋白表達——難度蛋白表達“急救包”
此外，我司無細胞蛋白表達平臺已成功用于合成各種分子量的蛋白質(zhì)，從單結(jié)構(gòu)域到多結(jié)構(gòu)域、單個亞基到多亞基蛋白復合體，分子量從10 kDa到160 kDa，PLD無細胞蛋白表達系統(tǒng)都能勝任，并得到活性驗證。
場景3：高通量篩選——抗體優(yōu)化的"全自動工廠"
在抗體藥物研發(fā)中，高通量篩選（HTS）已成為縮短開發(fā)周期、提升抗體性能的核心技術(shù)。然而，傳統(tǒng)細胞表達系統(tǒng)的局限性，使得這一過程仍面臨效率與成本的博弈。比如現(xiàn)代抗體工程（如噬菌體展示、單B細胞測序）可生成數(shù)百萬種候選序列，但傳統(tǒng)細胞表達僅能逐批測試，耗時數(shù)月?？贵w需同時滿足親和力、穩(wěn)定性、可溶性、低免疫原性等要求，傳統(tǒng)方法需分步測試。
珀羅汀生物案例：打造高通量無細胞蛋白表達工作站
我司打造的高通量無細胞蛋白表達工作站，實現(xiàn)抗體篩選技術(shù)的革命性突破！該平臺具備三大優(yōu)勢：
超高通量篩選能力：每日可完成3000個抗體的自動化篩選，將傳統(tǒng)以周/月為單位的篩選周期壓縮至24小時內(nèi)，真正實現(xiàn)"今日設計-明日驗證"的研發(fā)新范式。
全流程無人化操作：從DNA模板到功能抗體的全自動合成系統(tǒng)，支持線性化DNA片段直接表達，數(shù)小時內(nèi)表達候選抗體，全程無需人工干預和純化步驟。
全抗體類型兼容：突破性解決二硫鍵正確配對難題，可高效表達從VHH、scFv等小分子片段到Fab、全長抗體的所有類型。
詳情鏈接：抗體篩選“天選”模式，日篩抗體三千個
結(jié)語
在生命科學研究和藥物開發(fā)中，蛋白表達技術(shù)始終是突破創(chuàng)新的核心驅(qū)動力。無細胞蛋白表達技術(shù)以其快速、靈活、高效的優(yōu)勢，正在重塑傳統(tǒng)蛋白研究的邊界——無論是結(jié)構(gòu)復雜的全長膜蛋白、傳統(tǒng)系統(tǒng)難以駕馭的高難度蛋白，還是需要精準修飾的非天然氨基酸插入蛋白，都能通過這一技術(shù)獲得突破性進展。
參考文獻
1.Maharjan A, Park JH. Cell-free protein synthesis system: A new frontier for sustainable biotechnology-based products. Biotechnol Appl Biochem. 2023;70(6):2136-2149. doi:10.1002/bab.2514.
2.Dobson L, Tusnády GE. MemDis: Predicting Disordered Regions in Transmembrane Proteins. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12270. Published 2021 Nov 12. doi:10.3390/ijms222212270.
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4.Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023 Jul;48(7):642-654.
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