以往的qPCR檢測多為單重檢測，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，多重qPCR因能顯著提升效率（省時(shí)省力）而于臨床檢測中越發(fā)受到關(guān)注。然而，多重qPCR實(shí)驗(yàn)也會(huì)面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)，其中之一便是“漏光”現(xiàn)象——即熒光通道間的交叉干擾。了解并克服它是獲取可靠結(jié)果的關(guān)鍵。

一、問題的發(fā)現(xiàn)：并非擴(kuò)增的“擴(kuò)增曲線”

在一次實(shí)驗(yàn)中（算法：相對熒光值法-log），我們進(jìn)行了三重體系的擴(kuò)增檢測。奇特的是，雖然只在體系中加入了FAM通道的模板，HEX通道卻也出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增曲線。這顯然不符合預(yù)期。檢查原始曲線后確認(rèn)，HEX通道實(shí)際上并無真實(shí)的擴(kuò)增信號。

擴(kuò)增曲線圖（相對熒光值法-log）：

原始曲線圖：

二、問題的來源：算法與物理特性的雙重影響

經(jīng)過分析與多方咨詢，問題主要來自于兩方面：

1.算法影響：擴(kuò)增曲線算法選擇了“相對熒光值法-log”，此算法的優(yōu)點(diǎn)在于能更清晰地顯示出微弱的擴(kuò)增信號（尤其適用于多重實(shí)驗(yàn)中信號強(qiáng)度變化差異大的情況，此時(shí)若是選擇與原始曲線差異不大的絕Abs olute對 Quantification熒光值法便可能會(huì)誤導(dǎo)結(jié)果判讀）。

擴(kuò)增曲線-絕Abs olute 對Quantification熒光值法：

可以看到絕Abs olute對 Quantification熒光值法下的擴(kuò)增曲線HEX很平坦，但仍與閾值線有交叉。

2.物理特性：熒光染料的發(fā)射光譜并非特點(diǎn)典型的單峰，而是具有一定寬度的“波包”。這導(dǎo)致相鄰?fù)ǖ溃ㄈ?/span>FAM & HEX/VIC, CY5 & ROX）間存在一定程度的光譜重疊，從而產(chǎn)生信號干擾（通常低于1%，但也存在儀器間差異，建議定期校準(zhǔn)儀器）。

下面用這次實(shí)驗(yàn)中的FAM和HEX通道的原始曲線熒光強(qiáng)度做個(gè)展示。

FAM通道原始曲線13循環(huán)處熒光：

FAM通道原始曲線35循環(huán)處熒光：

HEX通道原始曲線13循環(huán)處熒光：

HEX通道原始曲線35循環(huán)處熒光：

本次實(shí)驗(yàn)中HEX受到FAM“漏光”的程度：（46.69-20.62）/（4635.65-2580.53）=0.0127。

三、問題的優(yōu)化策略

熒光光譜重疊是物理本質(zhì)，雖難以消除，但可通過策略盡可能減少干擾影響：

1.結(jié)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)忽略無模板通道：

在已知特定通道無目標(biāo)模板的多重檢測（如同系列實(shí)驗(yàn)或固定試劑盒方案）中，明確忽略該通道結(jié)果即可。

2.原始曲線輔助判讀是關(guān)鍵：

無論算法如何處理，原始曲線代表了儀器探測到的原始熒光信號。當(dāng)擴(kuò)增曲線形態(tài)異常（如本例或基線設(shè)置不當(dāng)導(dǎo)致時(shí)），回歸原始曲線是判斷真?zhèn)螖U(kuò)增的關(guān)鍵。

3.儀器定期校準(zhǔn)：

按照儀器制造商的要求進(jìn)行定期校準(zhǔn)，好的設(shè)備是保障實(shí)驗(yàn)正常開展的基礎(chǔ)。

4.巧妙避免算法影響：

相對熒光值算法利用了除法放大信號變化，這樣一來若是本底信號本身夠強(qiáng)（比如預(yù)載相應(yīng)探針），便能有效覆蓋交叉干擾帶來的本底變化，使得在相對熒光值法下，該通道也能保持明顯的非擴(kuò)增狀態(tài)。

下面是來自上海翼和SPF級大小鼠國標(biāo)病原體檢測系列試劑盒的“國標(biāo)必檢病毒聯(lián)檢”項(xiàng)目的陽性對照PC3，該陽性對照無ROX通道模板，但由于聯(lián)檢試劑盒ROX通道有對應(yīng)探針，本底信號覆蓋了干擾。

翼和國標(biāo)必檢病毒聯(lián)檢PC3擴(kuò)增曲線（相對熒光值法-log）：

翼和國標(biāo)必檢病毒聯(lián)檢PC3原始曲線：