WB 抗體剝離緩沖液 與膜再生液:Western Blot 實驗的高效復用方案
抗體剝離:將已完成檢測的膜從雜交袋或孵育盒中取出,用 TBST 緩沖液輕輕漂洗 2 - 3 次,去除膜表面殘留的緩沖液和未結(jié)合的抗體。將適量溫和型抗體剝離緩沖液加入容器中,確保膜浸泡其中,室溫下緩慢振蕩孵育 10 - 15 分鐘 。孵育過程中,可觀察到緩沖液顏色可能因抗體脫離而發(fā)生輕微變化。孵育結(jié)束后,棄去剝離緩沖液,用 TBST 緩沖液充分洗滌膜 3 - 5 次,每次 5 分鐘,去除殘留的剝離緩沖液。
膜再生:將洗滌后的膜浸入膜再生液中,室溫振蕩孵育 15 - 20 分鐘 。再生液中的成分能夠修復蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),恢復膜的抗原結(jié)合能力。再生完成后,用 TBST 緩沖液再次洗滌膜 3 - 5 次,每次 5 分鐘,去除再生液殘留。此時,膜即可用于下一輪抗體孵育,按照常規(guī) Western Blot 流程進行封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯色檢測。
操作溫度控制:整個抗體剝離與膜再生過程應(yīng)在室溫(20 - 25℃)下進行,避免高溫導致蛋白質(zhì)不可逆變性。低溫會降低反應(yīng)速率,延長處理時間,也可能影響剝離和再生效果。
剝離時間優(yōu)化:不同的抗體 - 抗原結(jié)合強度存在差異,剝離時間需根據(jù)實際情況優(yōu)化。對于結(jié)合緊密的抗體,可適當延長剝離時間,但不宜超過 20 分鐘,以免過度處理損傷蛋白質(zhì) 。初次使用時,建議設(shè)置不同剝離時間的平行實驗,確定最佳處理條件。
膜的保存與重復使用次數(shù):再生后的膜若暫時不使用,可將其浸泡在 TBST 緩沖液中,4℃保存,但保存時間不宜過長,以免蛋白質(zhì)降解或膜發(fā)生霉變。一般來說,同一張膜重復使用次數(shù)建議不超過 3 - 5 次 ,隨著使用次數(shù)增加,膜的抗原結(jié)合能力和蛋白質(zhì)完整性會逐漸下降,可能影響檢測靈敏度和結(jié)果準確性。
安全防護:部分剝離緩沖液和再生液成分具有一定的腐蝕性或刺激性,操作時需佩戴手套、護目鏡等防護用具,避免接觸皮膚和眼睛。使用后的廢液應(yīng)按照實驗室規(guī)定進行妥善處理,防止環(huán)境污染。
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