質(zhì)粒載體構(gòu)建的步驟

來源：上海基屹生物科技有限公司 2025年07月22日 14:39

　　質(zhì)粒載體構(gòu)建的步驟：

　　載體選擇與設(shè)計：

　　根據(jù)研究需求選擇合適的質(zhì)粒載體，考慮其多克隆位點(diǎn)、抗生素抗性標(biāo)記、復(fù)制子和啟動子等元素。

　　設(shè)計插入片段，確認(rèn)需要插入的基因序列，并選擇合適的啟動子和終止子以確?；蚰軌蛴行П磉_(dá)。

　　目的片段獲?。?br />

　　目標(biāo)基因可以通過PCR擴(kuò)增、化學(xué)合成或從現(xiàn)有質(zhì)粒/基因組中提取等方式獲得。

　　若通過PCR擴(kuò)增獲取目的片段，需設(shè)計特異性引物，并在引物兩端添加合適的酶切位點(diǎn)以便后續(xù)插入載體。

　　載體與目的片段處理：

　　使用限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切，形成插入基因所需的粘性端或平端。

　　同樣使用合適的酶對目標(biāo)基因進(jìn)行酶切，確保切割產(chǎn)生的端與載體匹配以便連接。

　　連接反應(yīng)：

　　將載體和插入片段按一定摩爾比混合，加入T4 DNA連接酶(或其他連接酶)，并設(shè)定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件(如溫度、時間)進(jìn)行連接。

　　連接效率受載體與片段投入量、反應(yīng)時間等因素影響，需進(jìn)行條件優(yōu)化。

　　轉(zhuǎn)化與篩選：

　　將連接后的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞(如大腸桿菌DH5α)中，通過熱擊法或電擊法實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。

　　將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞接種到含有抗生素的培養(yǎng)基上，通過抗生素抗性篩選出攜帶重組質(zhì)粒的菌落。

　　陽性克隆鑒定：

　　對篩選出的菌落進(jìn)行菌落PCR或酶切鑒定，驗證插入片段的正確性。

　　若需要進(jìn)一步確認(rèn)序列正確性，可將質(zhì)粒送去測序。

相關(guān)產(chǎn)品

凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對其真實性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。

99超碰中文字幕在线观看-天天干天天日天天舔婷婷-我看操逼的好看的女人的-日本一二三四五区日韩精品