01. 什么是通用型iPSCs？

通用型誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）是指經(jīng)過(guò)基因編輯處理，能夠降低免疫原性、避免免疫識(shí)別與攻擊，從而可適用于異體移植的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。此類細(xì)胞在異體移植場(chǎng)景中不會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，具有“現(xiàn)成”可用、經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)，能夠?yàn)榇笠?guī)模臨床應(yīng)用提供適合的細(xì)胞來(lái)源，推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)及基因治療技術(shù)的發(fā)展。

人類白細(xì)胞抗原（HLA）是細(xì)胞表面的關(guān)鍵分子，免疫系統(tǒng)通過(guò)其來(lái)區(qū)分自身和非自身細(xì)胞。在異體移植中，供體與受者的HLA不匹配會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。通用型iPSCs的構(gòu)建需要對(duì)HLA分子進(jìn)行基因編輯，以減少或消除HLA的表達(dá)，從而避免免疫系統(tǒng)的識(shí)別與攻擊。然而，HLA分子分為I類和II類，占據(jù)基因組的較大區(qū)域，難以通過(guò)單一基因編輯策略刪除。研究發(fā)現(xiàn)，敲除β?微球蛋白（β?M）亞基可以有效抑制HLA-I類分子的表達(dá)²，而敲除CIITA轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制HLA-II類分子的表達(dá)³。通過(guò)聯(lián)合敲除這兩種基因，可以實(shí)現(xiàn)iPSCs中HLA分子的全面抑制。

然而，HLA-I類分子的缺失會(huì)導(dǎo)致自然殺傷（NK）細(xì)胞的攻擊性顯著增強(qiáng)，因?yàn)镹K細(xì)胞通過(guò)識(shí)別HLA-I類分子上的特定配體來(lái)判斷細(xì)胞是否正常。為了逃逸NK細(xì)胞的攻擊，部分研究嘗試僅保留HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G等亞類分子^4,5，但這樣的iPSCs仍然無(wú)法避免免疫排斥反應(yīng)，僅能視為“半通用”細(xì)胞。因此，構(gòu)建通用型iPSCs的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于有效地防止NK細(xì)胞的攻擊¹。近期的研究進(jìn)展表明，通過(guò)抑制NK細(xì)胞激活受體（KAR）的配體表達(dá)，例如敲除CD155基因并保留HLA-E分子，可以使iPSCs在逃逸NK細(xì)胞識(shí)別的同時(shí)，仍然保留對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制能力6。然而，NK細(xì)胞通過(guò)多種KAR與不同的配體結(jié)合，且配體表達(dá)水平會(huì)因細(xì)胞類型而異，這增加了通用型iPSCs構(gòu)建的復(fù)雜性。

02. 蛋白表達(dá)篩選驗(yàn)證基因敲除或敲低的蛋白編碼序列

流式細(xì)胞術(shù)和ELISA在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白時(shí)存在局限性，傳統(tǒng)Western Blot耗時(shí)且重復(fù)性差。相比之下，Simple Western技術(shù)的Jess平臺(tái)能高效檢測(cè)膜結(jié)合蛋白及細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)蛋白，僅需3 µL iPSCs裂解液即可實(shí)現(xiàn)可重復(fù)定量分析，并可用于篩選殘留Cas9蛋白，保障工程化iPSCs的安全性。

利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建了靶向 HLA和KAR配體的基因敲除文庫(kù)（表1）。

表 1 iPSCs 中的基因敲低靶標(biāo)。β?M和CIITA敲除分別抑制HLA-1和HLA-2；BAT3、CD155和MICA為已知KAR配體。CIITA和BAT3為胞內(nèi)定位，其余為表面暴露靶點(diǎn)。

圖 2  Simple Western 篩選KAR配體敲除iPSCs克隆。RePlex™ 模塊用于在探針 1（左）中同時(shí)檢測(cè) BAT3、CD155 和 MICA，在探針 2（右）中通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)總蛋白。

圖3 顯示的是以野生型為對(duì)照，量化各克隆的敲低百分比，并將流式與Simple Western 進(jìn)行對(duì)比。

Simple Western顯示多數(shù)克隆的靶點(diǎn)敲低率高于流式（圖3，表2）。克隆#7對(duì)5個(gè)靶點(diǎn)的敲低具有良好效果（除BAT3為69%外，其余均低于野生型50%）。

表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 數(shù)值表示相對(duì)于野生型對(duì)照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量設(shè)為100%，敲低為0%）

03. 殘留Cas9篩選

CRISPR-Cas9工程化iPSCs需監(jiān)測(cè)殘留Cas9，Simple Western檢測(cè)顯示所有克隆的Cas9均低于6.4 ng/mL重組對(duì)照（圖4）

圖 4 Simple Western 篩選工程 iPSCs 中的殘留 Cas9

經(jīng)基因改造成為通用低免疫原性供體的iPSCs需在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行功能驗(yàn)證。在此環(huán)節(jié)中，Simple Western技術(shù)相比于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析方法，在以下幾個(gè)方面展現(xiàn)出它的優(yōu)勢(shì)：

(1) Simple Western儀器可無(wú)差別檢測(cè)全細(xì)胞裂解液、表面蛋白及純化蛋白，全程僅需3小時(shí)且無(wú)需人工操作。

(2) 傳統(tǒng)Western blot方法可輕松轉(zhuǎn)移至Simple Western平臺(tái)。作為毛細(xì)管電泳免疫分析，其提供尺寸特異性及抗體靶向檢測(cè)，已驗(yàn)證抗體超5,000種。

(3) Simple Western檢測(cè)僅需 3 μL 微量樣本, 無(wú)需延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。

(4) Simple Western具有高重復(fù)性、高靈敏度及定量分析功能。作為開(kāi)放式毛細(xì)管Western blot技術(shù)平臺(tái)，Simple Western用戶可自由選用任何商業(yè)化或定制抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白及其異構(gòu)體的特異性檢測(cè)。

* 參考文獻(xiàn):

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3. DeSandro A, Nagarajan UM, Boss JM. The bare lymphocyte syndrome: molecular clues to the transcriptional regulation of major histocompatibility complex class II genes. Am J Hum Genet. 1999;65(2):279–286.

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5. Kitano Y, Nishimura S, Kato TM, Ueda A, Takigawa K, Umekage M, Nomura M, Kawakami A, Ogawa H, Xu H, Hotta A, Takasu N, Tsukahara M. Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 system and detailed evaluation for clinical application. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 May 29;26:15-25.

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