一、背景

MN9D小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞來源于一位72歲的男性結(jié)直腸癌患者的肺部轉(zhuǎn)移灶；皮下接種至BALB/c裸鼠并連續(xù)傳代23次后建立該細(xì)胞系。在裸鼠身上傳代的過程中，該腫瘤仍保持原始的結(jié)直腸癌的組織學(xué)特性。該細(xì)胞有多種肽類激素和神經(jīng)遞質(zhì)的受體，維持電解質(zhì)的定向運(yùn)輸。

二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

三、應(yīng)用

用于mTOR信號通路在雷帕霉素調(diào)控錳誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞凋亡中的作用研究：

以小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞（MN9D）為模型,探討雷帕霉素在調(diào)控錳誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制,探討mTOR信號通路在雷帕霉素調(diào)控錳誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞凋亡中作用及其可能機(jī)制,為防治職業(yè)人群錳中毒提供研究基礎(chǔ)。

方法：

1、MN9D細(xì)胞在雷帕霉素（0.1μg/ml）預(yù)處理1h后分別暴露1.2和2.4m M錳24h。然后,觀察細(xì)胞形態(tài)、臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)量、Annexin V/PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、Western blot分析MN9D細(xì)胞caspase-3激活程度。

2、MN9D細(xì)胞在雷帕霉素RAP（0.1μg/ml）/mTOR激動劑MHY（1μM）預(yù)處理1h后暴露1.2 m M錳24h。然后,觀察細(xì)胞形態(tài)、臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)量、Annexin V/PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、western blot分析MN9D細(xì)胞caspase-3激活和mTOR相關(guān)蛋白變化。

結(jié)果：

1、與對照組相比,錳以濃度依賴的方式誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞活性下降和形態(tài)改變,凋亡率逐漸升高,cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量也逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而與染錳組相比,雷帕霉素預(yù)處理能夠明顯削弱錳誘導(dǎo)的MN9D細(xì)胞活性下降和調(diào)亡表現(xiàn),阻滯錳誘導(dǎo)caspase-3激活,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2、與對照組相比,單獨(dú)染錳組MN9D細(xì)胞活性下降和形態(tài)改變,凋亡率增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;AKT和和S6K1、4E-BP1蛋白磷酸化表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

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