熒光分子在生物研究中的應(yīng)用是許多應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，并且由于其具有多功能性、靈敏度和定量能力，其用途在不斷增加。在眾多用途中，熒光探針用于檢測(cè)蛋白位置和活化，識(shí)別蛋白復(fù)合物形成和構(gòu)象改變以及監(jiān)測(cè)體內(nèi)的生物過(guò)程。使用免疫熒光方法來(lái)展現(xiàn)這張代表性圖像。

使用熒光基團(tuán)偶聯(lián)抗體檢測(cè)靶蛋白。小鼠皮層神經(jīng)元中的突觸素（紅色）和微管相關(guān)蛋白 2（MAP2；綠色）分別使用特異性一抗和 Thermo Scientific DyLight 650 偶聯(lián)的山羊抗家兔或 DyLight 488-Goat 抗小鼠二抗進(jìn)行熒光標(biāo)記。均使用 Hoechst 染料標(biāo)記兩面板中的細(xì)胞核。

本頁(yè)內(nèi)容

· 熒光介紹

· 熒光基團(tuán)種類

· 熒光檢測(cè)和定量

· 熒光標(biāo)記

· 影響熒光發(fā)射或檢測(cè)的因素

熒光介紹

熒光的機(jī)制

熒光分子也稱為熒光基團(tuán)或簡(jiǎn)單稱為熒光體，與其他分子相比，它對(duì)光具有明顯響應(yīng)。如下文所示，激發(fā)光光子被熒光微球的電子吸收，從而將電子的能量水平提高到激發(fā)狀態(tài)。在這一短暫的激發(fā)期內(nèi)，部分能量會(huì)通過(guò)分子碰撞消散或轉(zhuǎn)移到近端分子，剩余的能量會(huì)作為光子發(fā)射，從而讓電子恢復(fù)其基態(tài)。由于發(fā)射的光子通常攜帶更少的能量，因此波長(zhǎng)比激發(fā)光子更長(zhǎng)，從而將發(fā)射熒光與激發(fā)光相區(qū)分。熒光基團(tuán)的激發(fā)和光子發(fā)射具有周期性，且直至熒光基團(tuán)發(fā)生不可逆地受損（參見(jiàn)見(jiàn)下文的光子漂白）前，其可重復(fù)激發(fā)。因此熒光基團(tuán)可以通過(guò)該激發(fā)和發(fā)射周期發(fā)射許多光子，可用于多種研究應(yīng)用。

熒光的 Jablonski 能量圖。

熒光光譜

激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都是每種熒光基團(tuán)的特異性特性，雖然這些波長(zhǎng)與單原子熒光基團(tuán)處于離散狀態(tài)，但多原子熒光基團(tuán)表現(xiàn)出廣泛的激發(fā)和發(fā)射光譜。在 X-Y 圖上繪制熒光分子（單原子和多原子）光譜，表明與每個(gè)熒光基團(tuán)的最大和最小激發(fā)和發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，如下圖（左圖）所示。請(qǐng)注意，由于在發(fā)射前存在部分能量損失，盡管發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)（如上所示），但發(fā)射強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)的振幅成正比，如下圖（右圖）(2) 中的激發(fā)能量（Ex 1 和 Ex2）及其相應(yīng)的發(fā)射強(qiáng)度（分別為 Em1 和 Em2）所示。

熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜以及激發(fā)振幅和發(fā)射強(qiáng)度之間的相關(guān)性。熒光基團(tuán)激發(fā)和發(fā)射光譜的總圖（左）。發(fā)射光的強(qiáng)度（Em1 和 Em2）與激發(fā)任何激發(fā)波長(zhǎng)（分別為 Ex1 和 Ex2；右）的熒光基團(tuán)所需的能量成正比。

斯托克斯位移

激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的距離稱為斯托克斯位移（參見(jiàn)下文），是生物學(xué)應(yīng)用中檢測(cè)發(fā)射熒光的關(guān)鍵方面。斯托克斯位移也是每個(gè)熒光基團(tuán)的明顯特征。例如，當(dāng)使用斯托克斯位移很小的熒光基團(tuán)（右圖）時(shí)，對(duì)發(fā)射熒光進(jìn)行檢測(cè)可能很難區(qū)分激發(fā)光，因?yàn)榧ぐl(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)在較大程度上存在重疊。相反，由于激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)之間存在很大分離，很容易區(qū)分具有較大斯托克斯位移的熒光基團(tuán)（左圖）。斯托克斯位移在多通路熒光應(yīng)用中尤為關(guān)鍵，因?yàn)橐粋€(gè)熒光體的發(fā)射波長(zhǎng)可能會(huì)重疊，因此會(huì)激發(fā)同一樣品中的另一個(gè)熒光體。

熒光基團(tuán)激發(fā)和發(fā)射光譜的斯托克斯位移。具有較高斯托克斯位移的熒光基團(tuán)（左）顯示樣品中激發(fā)光和發(fā)射光之間存在清晰區(qū)分，而對(duì)于斯托克斯位移較小的熒光基團(tuán)（右），由于激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的差異較小，則顯示更高的背景信號(hào)。

顏色范圍

電磁頻譜指各種電磁輻射波長(zhǎng)的較大范圍，可見(jiàn)光光譜僅限于這些波長(zhǎng)中極小的子集，如下所示。由于對(duì)超出可見(jiàn)光譜進(jìn)行檢測(cè)時(shí)存在限制，因此基于熒光的早期研究應(yīng)用采用僅在電磁光譜可見(jiàn)光范圍 (390 – 700 nm) 中發(fā)射的熒光基團(tuán)。依賴于如今的技術(shù)進(jìn)步，人們能夠檢測(cè)出可見(jiàn)光譜邊界以外的熒光基團(tuán)，并檢測(cè)到電磁光譜的紫外 (UV) 和紅外 (IR) 范圍。這些新型熒光基團(tuán)和檢測(cè)器為全新和開(kāi)發(fā)的應(yīng)用提供了更出色的可變性、多功能性和多重檢測(cè)能力。

指示近似波長(zhǎng)的可見(jiàn)光光譜。

熒光基團(tuán)亮度

特定熒光基團(tuán)的亮度由摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率確定，兩者均具有特異性。摩爾消光系數(shù) (ε) 定義為在給定波長(zhǎng)下可以被熒光吸收的光量（測(cè)量單位：M^-1 cm^-1）。量子產(chǎn)率 (Φ) 的計(jì)算方式為熒光發(fā)射的光子數(shù)量除以吸收的光子數(shù)量。熒光基團(tuán)亮度的計(jì)算方式為將 ε 和 Φ 相乘。

熒光基團(tuán)種類

盡管熒光化學(xué)以及技術(shù)發(fā)現(xiàn)的發(fā)展推動(dòng)了多種不同類型熒光基團(tuán)的開(kāi)發(fā)，但近 100 年來(lái)的生物研究仍然使用了熒光。大量的熒光基團(tuán)可以為研究應(yīng)用提供比以往任何時(shí)候更高的靈活性、變異性和熒光基團(tuán)性能。熒光染料可分為三組通用組：

· 有機(jī)染料

· 生物熒光基團(tuán)

· 量子點(diǎn)

每個(gè)熒光基團(tuán)都具有不同的特征，在決定使用哪種熒光基團(tuán)用于給定的應(yīng)用或?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)考慮這一點(diǎn)。

有機(jī)染料

熒光素等合成有機(jī)染料，是生物學(xué)研究中使用的熒光化合物。已對(duì)此類原始化合物的衍生物進(jìn)行加工，以提高其光穩(wěn)定性和溶解度。還針對(duì)此類染料開(kāi)發(fā)了衍生物，用于生物偶聯(lián)，特別是異硫氰酸熒光素 (FITC)、羅丹明（四甲基羅丹明異硫氰酸鹽，TRITC）和具有更高性能的市售類型。對(duì)于生物偶聯(lián)策略而言，這些熒光體的小尺寸是優(yōu)于生物偶聯(lián)熒光基團(tuán)的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兛梢耘c抗體、生物素或親和素大分子交聯(lián)，而不會(huì)干擾正常的生物學(xué)功能。具有特征激發(fā)/發(fā)射光譜和量子產(chǎn)率和激發(fā)系數(shù)的多種染料，可市售用于任何熒光應(yīng)用。

生物熒光基團(tuán)

雖然人們已在千年前了解到存在生物發(fā)光，但研究應(yīng)用中的生物熒光基團(tuán)的使用發(fā)生在 1990 年代，當(dāng)時(shí)綠色熒光蛋白 (GFP) 由維多利亞多管發(fā)光水母克隆而來(lái)，作為基因表達(dá)報(bào)告基因 (3)。自此，原 GFP、藻膽蛋白（別藻藍(lán)蛋白、藻青蛋白、藻紅蛋白和藻膽蛋白）以及許多其他蛋白均被設(shè)計(jì)用于生物表達(dá)系統(tǒng)，它們的使用現(xiàn)在在生物研究中已經(jīng)十分常見(jiàn)。

這類熒光基團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)在于可將表達(dá)質(zhì)粒引入細(xì)菌、細(xì)胞、器官或全生物中，以驅(qū)動(dòng)該熒光基團(tuán)單獨(dú)表達(dá)或在研究的生物過(guò)程背景下融合至目標(biāo)蛋白的表達(dá)。使用熒光蛋白可能很耗時(shí)，表達(dá)將大量產(chǎn)生光蛋白，該蛋白可能會(huì)產(chǎn)生活性氧簇，并誘導(dǎo)實(shí)際反應(yīng)或毒性。此外，熒光蛋白的大小可以改變熒光基團(tuán)融合到的細(xì)胞蛋白的正常生物學(xué)功能，生物熒光基團(tuán)通常不會(huì)具有合成熒光染料所具有的光穩(wěn)定性和靈敏度水平。

量子點(diǎn)

量子點(diǎn)是具有化學(xué)特性的納米晶體，可嚴(yán)格控制熒光體的光譜特性。量子點(diǎn)于 1980 年代開(kāi)發(fā)，自 1990 年代以來(lái)，已越來(lái)越多地用于生物研究的熒光應(yīng)用。量子點(diǎn)是納米級(jí)尺寸 (2-50 nm) 的半導(dǎo)體，在激發(fā)時(shí)，會(huì)根據(jù)顆粒的大小發(fā)射某一波長(zhǎng)的熒光；相較于大量子點(diǎn)，較小的量子點(diǎn)會(huì)發(fā)射更高的能量，因此隨著納米晶體尺寸的增加，發(fā)射光從藍(lán)色轉(zhuǎn)換為紅色。由于量子點(diǎn)大小可以嚴(yán)格控制，因此與其他熒光體相比，對(duì)于不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)具有更高的特異性。 

使用 Qdot 二抗偶聯(lián)物進(jìn)行多色免疫熒光成像小鼠腎層粘連蛋白被標(biāo)記上抗層粘連蛋白一抗，用綠色熒光素 Qdot 565 IgG 顯色。血小板/內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（PECAM 又名 CD31）被標(biāo)記為抗 PECAM-1一抗，用紅色熒光 Qdot 655 IgG 顯色。細(xì)胞核使用藍(lán)色熒光素 Hoechst 33342 染色

據(jù)報(bào)告，量子點(diǎn)比其他熒光基團(tuán)更具光穩(wěn)定性，因?yàn)橐环輬?bào)告顯示，量子點(diǎn)在可在體內(nèi)成像研究中保持 4 個(gè)月的熒光狀態(tài) (1)。此外，量子點(diǎn)可以包被用于蛋白標(biāo)記等不同生物學(xué)應(yīng)用。雖然在生物應(yīng)用中對(duì)量子點(diǎn)的使用處于上升狀態(tài)，但由于顆粒的分解 (4)，據(jù)報(bào)告存在細(xì)胞毒性，并且其使用成本過(guò)高。

熒光檢測(cè)和定量

檢測(cè)策略

我們開(kāi)發(fā)了多種不同類型的熒光檢測(cè)儀器，雖然每種儀器僅適用于都不同的實(shí)驗(yàn)方法，但所有熒光檢測(cè)儀器都具有四種基本要求：

· 激光、光電二極管或燈（氙弧燈和汞蒸汽燈最為常見(jiàn))等激發(fā)光源

· 熒光基團(tuán)

· 用于分離特定波長(zhǎng)以激發(fā)不同熒光基團(tuán)的濾光片

· 記錄輸出（通常是電子信號(hào)）的探測(cè)器

雖然此列表并不詳盡，并且我們還在不斷開(kāi)發(fā)新儀器，但常見(jiàn)的熒光檢測(cè)儀器包括以下儀器：

· 熒光顯微鏡 – 檢測(cè)樣品二維和三維的局部熒光劑

· 微陣列讀數(shù)儀等熒光掃描儀 – 檢測(cè)樣品在兩維的局部熒光劑

· 分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀 – 記錄樣品中的平均熒光

· 流式細(xì)胞儀 – 分析樣品群中單個(gè)細(xì)胞的熒光

定量

隨著數(shù)字顯微鏡的出現(xiàn)，已能夠在在所有熒光應(yīng)用中普遍發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)定量的存在，并且能夠測(cè)量以下各種參數(shù)：

· 細(xì)胞計(jì)數(shù)

· 定位于細(xì)胞或甚至離散細(xì)胞區(qū)室的熒光基團(tuán)量

· 基因表達(dá)率和蛋白合成率

· 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率或細(xì)胞內(nèi)組分的移動(dòng)速率

· 樣品中的 DNA 量、RNA 量或蛋白量

· DNA、RNA 或蛋白序列

· 酶活性

· 存活率

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，熒光定量需要專用軟件，可能需要熒光標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)校準(zhǔn)儀器。

熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記是將熒光基團(tuán)共價(jià)連接到其他蛋白或核酸等分子的過(guò)程。這通常通過(guò)使用熒光基團(tuán)的反應(yīng)性衍生物實(shí)現(xiàn)，該熒光基團(tuán)可選擇性地與靶分子中的官能團(tuán)結(jié)合。最常標(biāo)記的分子是抗體，抗體可用作檢測(cè)特定靶標(biāo)的特異性探針。熒光標(biāo)記可應(yīng)用于各種檢測(cè)系統(tǒng)，并可以進(jìn)行靈敏和定量測(cè)量。

熒光基團(tuán)偶聯(lián)

標(biāo)記分子需要熒光基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)性衍生物。常見(jiàn)反應(yīng)性基團(tuán)包括胺反應(yīng)性異硫氰酸鹽衍生物，包括 FITC、胺反應(yīng)性琥珀酰亞胺酯，例如 NHS 熒光素或 NHS 羅丹明以及巰基反應(yīng)性馬來(lái)酰亞胺活化熒光劑（例如：熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺）。這些反應(yīng)性染料與另一種分子的反應(yīng)可形成熒光基團(tuán)與標(biāo)記分子之間的穩(wěn)定共價(jià)鍵。異硫氰酸酯長(zhǎng)期以來(lái)一直用作主要反應(yīng)性化學(xué)試劑，通過(guò)賴氨酸側(cè)鏈的一級(jí)胺將熒光染料與蛋白連接。NHS 酯化學(xué)試劑現(xiàn)在是標(biāo)記方法，因?yàn)槠鋵?duì)一級(jí)胺具有更高的特異性，并在標(biāo)記程序后產(chǎn)生更穩(wěn)定的鍵。巰基反應(yīng)性化學(xué)組成在蛋白質(zhì)標(biāo)記中的應(yīng)用范圍較小，主要適用于需要保留賴氨酸殘基或特異性靶向半胱氨酸殘基以在標(biāo)記蛋白上定位熒光染料的情況。

NHS 熒光素和 FITC 的結(jié)構(gòu)；熒光素的兩種胺反應(yīng)性衍生物。

NHS 光素通過(guò) N羥基琥珀酰亞胺（NHS 酯）官能團(tuán)激活。與 FITC 相比，NHS 衍生物在存在其他親核試劑的情況下對(duì)一級(jí)胺具有更高的特異性，并在標(biāo)記后產(chǎn)生更穩(wěn)定的鍵。

NHS 熒光素和 FITC 的比較。

使用熒光素標(biāo)記的二抗檢測(cè) α 微管蛋白。A549 人肺癌細(xì)胞在 96 孔微孔板中生長(zhǎng) 18 – 20 小時(shí)，使用 4% 多聚甲醛（貨號(hào)：28906）固定，并使用 0.1% Surfact-Amps X-100（貨號(hào)：28314）透化處理。使用小鼠抗 α 微管蛋白一抗 (0.4 μg/mL) 和熒光素山羊抗小鼠二抗 (2 µg/mL) 通過(guò)探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行探查。使用 Hoechst 染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記。圖像通過(guò)熒光顯微鏡采集。A. 熒光圖像顯示了僅位于細(xì)胞質(zhì)中的α 微管蛋白（偽彩綠色）的精細(xì)網(wǎng)絡(luò)。B. 使用 Hoechst 染料進(jìn)行核復(fù)染（偽彩藍(lán)色）C. 合并圖像。

為檢測(cè)熒光信號(hào)，分子必須被充分標(biāo)記，同時(shí)不干擾分子的功能、溶解性、結(jié)合能力或激活性等正常生物特性。因此，熒光標(biāo)記需要優(yōu)化。

去除未反應(yīng)的熒光基團(tuán)

完成熒光標(biāo)記反應(yīng)后，通常需要從標(biāo)記的靶標(biāo)分子中去除所有未反應(yīng)的熒光基團(tuán)。這通常通過(guò)尺寸排除色譜法實(shí)現(xiàn)，利用熒光基團(tuán)、標(biāo)記蛋白以及核酸等之間的大小差異。然而，許多熒光基團(tuán)與常規(guī)的分離基質(zhì)相互作用，會(huì)導(dǎo)致回收率和分離效果不佳。因此，考慮熒光染料疏水特性的專用染料去除柱。使用市售染料去除柱，可以從小至 7kDa、大至 150 kDa IgG 的蛋白中去除染料分子。

影響熒光發(fā)射或檢測(cè)的因素

淬滅

熒光基團(tuán)發(fā)射可直接受其他熒光或非熒光分子的相互作用影響，而后者可以"猝滅"激發(fā)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。由于可在生物學(xué)事件的響應(yīng)中添加或去除淬滅劑，因此熒光淬滅通常用于確定蛋白的激活狀態(tài)或識(shí)別基因表達(dá)。

淬滅程度取決于淬滅劑分子的性質(zhì)（熒光基團(tuán)或非熒光基團(tuán)）、相互作用類型以及熒光體發(fā)射的能量波長(zhǎng)。熒光猝滅的方法包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)、碰撞猝滅和接觸猝滅，通過(guò)以下圖表表示。

在 FRET（也稱為 F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移）中，激發(fā)光將"供體"熒光體提高到激發(fā)狀態(tài)，從而導(dǎo)致光子釋放。"受體"分子可以是另一個(gè)熒光體或非熒光分子，與供體熒光體足夠接近，以吸收發(fā)射的光子，然后在非熒光分子情況下有效淬滅發(fā)射的光。當(dāng)使用熒光體作為淬滅劑時(shí)，發(fā)射的光子也會(huì)被淬滅，并且如果吸收的光子位于第二熒光體的激發(fā)波長(zhǎng)范圍內(nèi)，受體電子將被提升至激發(fā)狀態(tài)并在受體熒光體波長(zhǎng)處釋放光子。另一種作為淬滅劑的熒光體通常用于檢測(cè)供體熒光體的淬滅狀態(tài)，因?yàn)闊晒怏w并非在應(yīng)答供體熒光體的激發(fā)時(shí)檢測(cè)已知波長(zhǎng)的熒光，而是在淬滅熒光體的波長(zhǎng)處發(fā)射淬滅熒光。

FRET 光譜重疊積分的示意圖。該過(guò)程是兩種染料分子在電子激發(fā)狀態(tài)下之間的距離依賴性相互作用，其中激發(fā)作用從供體分子轉(zhuǎn)移至受體分子，而不發(fā)射光子。

表 1.Forster Radius 的 R0 典型值 – 注意： Forster 中 O 的上方有兩個(gè)圓點(diǎn)

接觸猝滅發(fā)生于激發(fā)前熒光基團(tuán)與淬滅分子復(fù)合時(shí)；由于熒光體與其他分子直接接觸，激發(fā)產(chǎn)生的能量立即轉(zhuǎn)移到接觸分子，并以熱的形式耗散。碰撞淬滅發(fā)生于激發(fā)熒光基團(tuán)與溶液中的淬滅劑反應(yīng)時(shí)，能量立即轉(zhuǎn)移到接觸的分子，激發(fā)熒光體隨之弛豫。

熒光淬滅類型圖。

背景熒光

在特定實(shí)驗(yàn)中，熒光基團(tuán)檢測(cè)可能會(huì)被高背景熒光干擾，這通常是由于未清除未結(jié)合的熒光探針或樣品自發(fā)熒光引起。清洗樣品或減少熒光探針的濃度可以降低背景熒光。但是，針對(duì)自發(fā)熒光問(wèn)題（定義為樣品中組分的內(nèi)源性熒光），需要考慮正確的探針組合或設(shè)備。生物樣品中的自發(fā)熒光通常在使用較短波長(zhǎng)激發(fā)光（通常 <500 nm）時(shí)發(fā)出。因此，可以使用不激發(fā)與樣品相同光譜的熒光體或?yàn)V光片組（專用于將激發(fā)光縮小至靶熒光染料的激發(fā)光），從而盡可能減少或避免自發(fā)熒光。

低熒光

低熒光強(qiáng)度可限制靶熒光基團(tuán)的檢測(cè)，在背景熒光較高時(shí)尤為如此。熒光強(qiáng)度可通過(guò)增加靶位點(diǎn)上的熒光分子數(shù)量而增強(qiáng)。這可以通過(guò)在實(shí)驗(yàn)或擴(kuò)增方法中使用更高濃度的探針來(lái)完成，以增加熒光基團(tuán)在靶位點(diǎn)的定位。由于增加探針濃度可能會(huì)沉淀探針?lè)肿硬?dǎo)致細(xì)胞畸變（細(xì)胞內(nèi)探針則更為嚴(yán)重）或自淬滅（因?yàn)榉肿娱g相互作用水平高；參見(jiàn)上文“淬滅”部分）或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此兩種方法都可以對(duì)信號(hào)檢測(cè)產(chǎn)生負(fù)面影響。

除了累積熒光探針數(shù)量外，由于激發(fā)強(qiáng)度與激發(fā)能量成正比，有時(shí)也可通過(guò)增加激發(fā)光強(qiáng)度來(lái)增強(qiáng)低熒光強(qiáng)度。但如下文所述，使用這種方法必須達(dá)到平衡，避免熒光褪色。

光漂白

光漂白是熒光團(tuán)基團(tuán)因長(zhǎng)時(shí)間暴露在激發(fā)光源下或高強(qiáng)度激發(fā)光下發(fā)生不可逆破壞的現(xiàn)象。通過(guò)將熒光體暴露于可能的極低激發(fā)光強(qiáng)度水平，以盡可能縮短或避免光漂白同時(shí)還實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)；這需要使用高靈敏度 CCD 相機(jī)、高數(shù)值孔徑物鏡和/或超寬帶帶通發(fā)射濾光片優(yōu)化檢測(cè)方法。其他方法包括使用比傳統(tǒng)熒光基團(tuán)更穩(wěn)定的光基團(tuán)和/或使用抗淬滅劑保護(hù)熒光體免受光漂白。避免光漂白的步驟并不適用所有檢測(cè)方法，應(yīng)該針對(duì)每種方法進(jìn)行優(yōu)化。例如，Intifada 試劑對(duì)活細(xì)胞具有毒性，因此只能用于固定細(xì)胞或組織。此外，由于熒光基團(tuán)在激發(fā)源下的曝光時(shí)間極短，因此流式細(xì)胞術(shù)等部分檢測(cè)方法，通常無(wú)需設(shè)置避免光漂白的步驟。以下示例說(shuō)明了熒光光光漂白現(xiàn)象。

Invitrogen Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546 染料、熒光素和 Cy3 熒光基團(tuán)針對(duì)光漂白率的對(duì)比。牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 (BPAEC) 的細(xì)胞骨架分別使用 Alexa Fluor® 488鬼筆環(huán)肽（上系列）、小鼠單克隆抗 α 微管蛋白抗體及 Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG 抗體標(biāo)記或熒光素鬼筆環(huán)肽（下系列）、抗 α 微管蛋白抗體及市售的 Cy3 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 抗體標(biāo)記。偽彩圖像每隔 30 秒拍攝（0、30、90、210 秒曝光）。圖片通過(guò)適合熒光素和羅丹明的帶通濾色片獲得。

推薦閱讀：

1. Ballou B. et al.(2004) Noninvasive imaging of quantum dots in mice.Bioconjug Chem.15, 79-86.

2. Encyclopedia of Chromatography: J. Cazes (Ed.); Marcel Dekker Inc., New York, 2001

3. Chalfie M. et al.(1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science.263, 802-5.

4. Mahendra S. et al.(2008) Quantum dot weathering results in microbial toxicity.Environ Sci Technol.42, 9424-30.

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