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熒光定量 PCR 中無(wú) Ct 值或 Ct值過(guò)晚,該如何解決?

來(lái)源:蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司   2025年07月08日 11:21  

在熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)里,無(wú) Ct 值出現(xiàn)和 Ct 值過(guò)晚是常讓科研人員頭疼的問(wèn)題。這些問(wèn)題會(huì)嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性,接下來(lái)我們就深入探討下背后的原因和解決辦法。

熒光定量 PCR 中無(wú) Ct 值或 Ct值過(guò)晚,該如何解決?

一、無(wú) Ct 值出現(xiàn)的原因及解決辦法

(一)循環(huán)數(shù)設(shè)置不合理  正常情況下,PCR 循環(huán)數(shù)一般不宜超過(guò) 45 循環(huán)。要是循環(huán)數(shù)設(shè)置不夠,可能因擴(kuò)增產(chǎn)物量不夠,熒光信號(hào)沒(méi)達(dá)到可檢測(cè)水平,導(dǎo)致無(wú) Ct 值。比如在一些低拷貝數(shù)模板的檢測(cè)中,若循環(huán)數(shù)只設(shè) 30 次,很可能就檢測(cè)不到產(chǎn)物。

解決辦法依據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和模板預(yù)估量,合理增加循環(huán)數(shù),不過(guò)要注意,循環(huán)數(shù)過(guò)高也會(huì)使背景值提高,定量不準(zhǔn),通常調(diào)整到 35 - 40 循環(huán)較為合適。

(二)PCR 程序里檢測(cè)熒光信號(hào)步驟有誤  不同熒光定量方法,采集熒光信號(hào)的時(shí)機(jī)有別。像 SG 法一般在 72℃延伸時(shí)采集,TaqMan 法則多在退火結(jié)束或延伸時(shí)采集。要是 PCR 程序設(shè)置時(shí),熒光采集步驟和所用方法不匹配,或者壓根沒(méi)勾選熒光采集選項(xiàng),那肯定檢測(cè)不到熒光信號(hào),也就沒(méi)有 Ct 值。

解決辦法:仔細(xì)核對(duì)所用熒光定量方法的說(shuō)明書,嚴(yán)格按要求設(shè)置 PCR 程序里熒光信號(hào)檢測(cè)步驟,確保準(zhǔn)確采集熒光信號(hào)。

熒光定量 PCR 中無(wú) Ct 值或 Ct值過(guò)晚,該如何解決?

(三)引物或探針降解  引物或探針降解后,無(wú)法正常和模板結(jié)合并引導(dǎo)擴(kuò)增,自然不會(huì)有擴(kuò)增產(chǎn)物,也就無(wú) Ct 值??赏ㄟ^(guò) PAGE 電泳檢測(cè)引物和探針是否降解,降解的引物或探針在電泳圖上會(huì)呈現(xiàn)出條帶模糊、拖尾等異常。

解決辦法重新合成高質(zhì)量引物和探針,注意引物和探針的保存條件,避免反復(fù)凍融,最好小量分裝,存放在 - 20℃或 - 80℃。

 

(四)模板降解或上樣量不夠  模板降解,完整性被破壞,擴(kuò)增難以進(jìn)行;上樣量不夠,起始模板拷貝數(shù)少,擴(kuò)增產(chǎn)物量也會(huì)很少,導(dǎo)致熒光信號(hào)弱,檢測(cè)不到 Ct 值。一般模板上樣量不超 500ng,對(duì)未知濃度樣本,應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。另外,樣本準(zhǔn)備過(guò)程中引入雜質(zhì)、反復(fù)凍融,都可能造成模板降解。

解決辦法優(yōu)化樣本提取和保存方法,確保模板質(zhì)量。提取后盡快實(shí)驗(yàn),如需保存,將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融。實(shí)驗(yàn)前,用核酸定量?jī)x精確測(cè)定模板濃度,依據(jù)濃度調(diào)整上樣量。

 

(五)引物探針設(shè)計(jì)不合理  引物設(shè)計(jì)要是不合理,像上下游引物 Tm 值差異超 4℃,會(huì)影響擴(kuò)增效率,甚至導(dǎo)致擴(kuò)增失敗,沒(méi)有 Ct 值;引物若不能跨越內(nèi)含子,擴(kuò)增基因組 DNA 時(shí),可能受內(nèi)含子干擾,影響結(jié)果。

解決辦法借助專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件,如 Primer Premier 5.0 等,精心設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)好后,進(jìn)行 BLAST 比對(duì),確保引物特異性,避免與其他基因序列有過(guò)多同源性。

 

二、Ct 值過(guò)晚的原因及解決辦法

(一)擴(kuò)增效率低


  1. 引物間或引物與探針比例不當(dāng):引物和探針濃度不合適,比如引物濃度過(guò)高,可能形成引物二聚體,競(jìng)爭(zhēng)模板結(jié)合位點(diǎn),降低擴(kuò)增效率;引物和探針比例失衡,也會(huì)影響擴(kuò)增。

解決辦法通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),優(yōu)化引物和探針濃度及比例,摸索出最佳反應(yīng)體系。

  1. 引物或探針設(shè)計(jì)不合理:引物長(zhǎng)度、GC 含量、特異性等不合適,都可能致使擴(kuò)增效率低,Ct 值過(guò)晚。比如引物長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng),退火時(shí)難以和模板配對(duì),影響擴(kuò)增。

解決辦法重新設(shè)計(jì)引物和探針,保證引物長(zhǎng)度適中(一般 18 - 25bp),GC 含量在 40% - 60%,同時(shí)具備高特異性。

(二)PCR 程序不合適

  1. 改用三步法反應(yīng):兩步法反應(yīng)中,退火和延伸在同一溫度進(jìn)行,可能對(duì)某些模板和引物組合效果欠佳。三步法將退火、延伸分開(kāi),能更好優(yōu)化反應(yīng)條件。

解決辦法嘗試將 PCR 程序改為三步法,即變性、退火、延伸分別在不同溫度下進(jìn)行,依據(jù)引物 Tm 值,合理設(shè)置退火溫度。

  1. 優(yōu)化退火 / 延伸溫度:退火溫度過(guò)高,引物和模板結(jié)合不充分;過(guò)低,易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。延伸溫度不合適,會(huì)影響 Taq 酶活性和擴(kuò)增效率。

解決辦法以引物 Tm 值為參考,適當(dāng)降低退火溫度(一般降低 3 - 5℃),優(yōu)化延伸溫度(通常 72℃左右),通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳溫度。

  1. 延長(zhǎng)退火 / 延伸時(shí)間:退火或延伸時(shí)間過(guò)短,引物和模板結(jié)合不充分,擴(kuò)增產(chǎn)物合成,導(dǎo)致 Ct 值過(guò)晚。

解決辦法在推薦時(shí)間基礎(chǔ)上,適當(dāng)延長(zhǎng)退火 / 延伸時(shí)間 10s 左右,觀察擴(kuò)增效果。

(三)MgCl?濃度不合適Mg²?是 Taq 酶活性必需離子,濃度過(guò)高或過(guò)低,都會(huì)影響 Taq 酶活性和擴(kuò)增效率。濃度過(guò)高,可能增加非特異性擴(kuò)增;過(guò)低,Taq 酶活性受抑制。

解決辦法依據(jù)所用 PCR 試劑盒推薦,適當(dāng)調(diào)整 MgCl?濃度,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度。

(四)PCR 產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)  PCR 產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò) 500bp,擴(kuò)增難度會(huì)增加,所需時(shí)間更長(zhǎng),導(dǎo)致 Ct 值過(guò)晚。因?yàn)殚L(zhǎng)片段擴(kuò)增對(duì)反應(yīng)條件要求更嚴(yán)苛,容易出現(xiàn)擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。

解決辦法重新設(shè)計(jì)引物,縮短 PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度,一般控制在 100 - 300bp,更利于高效擴(kuò)增。

熒光定量 PCR 中無(wú) Ct 值或 Ct值過(guò)晚,該如何解決?

(五)模板中存在抑制物     模板提取過(guò)程中,若混入蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)溶劑等雜質(zhì),這些物質(zhì)可能抑制 Taq 酶活性,降低擴(kuò)增效率,使 Ct 值過(guò)晚。解決辦法使用高純度模板進(jìn)行 PCR 檢測(cè),或?qū)δ0暹M(jìn)行稀釋,降低抑制物濃度。也可采用模板純化試劑盒,進(jìn)一步去除雜質(zhì)。      更多關(guān)于熒光定量 PCR 儀原理、熒光定量 PCR 儀品牌、熒光定量 PCR 儀價(jià)格、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)、熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)步驟等實(shí)驗(yàn)室儀器,實(shí)驗(yàn)耗材,生物試劑相關(guān)問(wèn)題,歡迎進(jìn)入蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司網(wǎng)站進(jìn)行了解。

 

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