百歐博偉生物：菌種在傳代過程中，因遺傳物質(zhì)發(fā)生變異而引起的原有的優(yōu)良性狀漸漸消失或變壞，出現(xiàn)長勢差、發(fā)酵效價不高、質(zhì)量不好、菌落叢生等現(xiàn)象。這些現(xiàn)象人們泛稱為“退化”。 菌種退化是一個漸變的過程，發(fā)生有害變異的個體在群體中顯著增多以至占據(jù)優(yōu)勢時才會顯露出來。因此盡管個體的變異可能是一個瞬時的過程，但菌種呈現(xiàn)“退化”卻需要較長的時間。菌種退化的本質(zhì)是染色體的變異，自然界中生物體發(fā)生變異是的，如果這種變異朝著人們認(rèn)為是壞的方向發(fā)展，就會造成退化。菌種的整體性能，在不因外界因素而逐漸變差，且會遺傳給下一代，就稱為菌株退化。

需要注意的是，退化和老化是兩個截然不同的概念。菌種培育過程中隨著菌齡的增加，養(yǎng)分不斷消耗，菌種必然會出現(xiàn)老化現(xiàn)象。菌體老化后，其生命力衰退，色素分泌增加，細(xì)胞中空泡增多，甚至破裂。老化的菌種接入培養(yǎng)基后表現(xiàn)為菌絲生長慢、抵抗雜菌能力弱、產(chǎn)酶能力下降等。老化現(xiàn)象不會傳給子代，這是與退化的區(qū)別。所以，一旦菌株出現(xiàn)了異?，F(xiàn)象，首先要分清是老化還是退化，或是單純因為外界培養(yǎng)條件發(fā)生變化而引起。如果是因老化或外界條件變化引起的異常, 采用新的培養(yǎng)基及適合的培養(yǎng)條件后菌株生長會恢復(fù)原狀；如果是因退化而引起，則不會改變生長的惡劣狀況，這時就要對菌株進(jìn)行復(fù)壯。本文將對菌種退化的原因加以簡析，并給出相應(yīng)有效的預(yù)防措施及復(fù)壯技術(shù)。

一、退化原因

1、有害突變及細(xì)胞遺傳學(xué)原因

根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)觀點，細(xì)胞變異和分裂速度密切相關(guān)，分裂速度越快，變異將會越多。微生物由于分裂速度很快，分裂中的變異數(shù)量將會增加，而菌種退化與細(xì)胞變異密切相關(guān)。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通常每三百個細(xì)胞中，就會出現(xiàn)一個變異。在多代傳代繁殖中，變異概率將會更高。當(dāng)菌種遺傳物質(zhì)發(fā)生變異之后，突變體往往更能適應(yīng)外界環(huán)境條件，變異的細(xì)胞再分裂，變異體將會越來越多，直到最后代謝能力退化。

2、生理代謝方面的原因

菌種制備時，菌體培養(yǎng)在特定的培養(yǎng)基上，這些培養(yǎng)基通常具備菌種生長、發(fā)育及繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖類、生長因子及水等。但是，由于各種營養(yǎng)物質(zhì)的配比不一定，即使一個優(yōu)良的菌株，如果長期使用基本相同的培養(yǎng)基，其營養(yǎng)不能達(dá)到生理要求，長此以往培育下去，必然造成營養(yǎng)不良。除了培養(yǎng)成分配比之外，培養(yǎng)環(huán)境也是重要方面，如果對其控制不當(dāng)，將會嚴(yán)重影響菌種的生長繁殖。比如微生物培養(yǎng)時，通常會分泌多種胞外酶，如纖維素酶、果膠酶及半纖維素酶等，以分解有機物進(jìn)而獲得營養(yǎng)及能量，當(dāng)培養(yǎng)條件不適合時，這些酶類分泌量會大幅度減少，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)無法利用，從而生長停止，如果這種情況長期發(fā)展下去，將會導(dǎo)致菌種退化。

3、保藏方式不當(dāng)或長期保藏

目前國內(nèi)外防止菌種退化的辦法是采用液態(tài)氮超低溫保藏。此外，菌種長期保存或長期使用后，菌絲長勢減弱，容易提前出現(xiàn)老化現(xiàn)象。一般的保藏方法，菌株雖在低溫下保藏，但并未停止其生命活動，仍然存在著變異的可能。

4、菌種混雜

在菌種繼代培養(yǎng)過程中，不同品種間交叉感染，導(dǎo)致不同品種的菌絲體混雜在一起，造成原有品種生產(chǎn)性狀的改變，常常表現(xiàn)出產(chǎn)量下降、質(zhì)量變劣等退化現(xiàn)象。

5、宿主（感受態(tài)）老化

對于基因工程菌來說，菌種退化是一個無法回避的問題，也是影響正常發(fā)酵生產(chǎn)的障礙。其具體表現(xiàn)形式一般為發(fā)酵早期溶菌、菌體生長緩慢、糖代謝異常、發(fā)酵OD低以及酶活（效價）差等，嚴(yán)重影響了發(fā)酵批次的穩(wěn)定性。對于工程大腸桿菌來說，其異常表現(xiàn)與污染噬菌體有類似之處，判斷起來有一定的迷惑性。而究其原因，大多數(shù)情況是由于宿主感受態(tài)自身發(fā)生老化或退化引起。這種情況下，即使更換發(fā)酵設(shè)備或者對發(fā)酵環(huán)境全面凈化處理也無濟(jì)于事。

二、菌種退化的預(yù)防及其復(fù)壯措施

1、定期分離菌種,以達(dá)到純化效果

在菌種培養(yǎng)中，為了保證菌種質(zhì)量，每隔1至2年，必須對原菌種進(jìn)行分離。菌種純化是常用的一種復(fù)壯方法。原理是定期分離菌種，將退化的菌種分離剔除，挑選出具有優(yōu)良性狀的菌株在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恢復(fù)菌種原有的生長狀態(tài)，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

2、控制菌種傳代次數(shù)

由于菌種退化和傳代次數(shù)密切相關(guān)，應(yīng)在培養(yǎng)中給予重視，一般情況下，代數(shù)不能超過5代。菌種在多次傳代過程中會發(fā)生少量基因的突變，到突變達(dá)到一定程度時，就會造成遺傳物質(zhì)的改變，然而頻繁傳代一般都是負(fù)變異占優(yōu)勢。因此，控制菌種的傳代次數(shù)也是防止菌種退化和維持原有性狀的有效措施之一。

3、采用適宜的保藏方法

建議采用液氮超低溫保藏，液氮超低溫保藏法是將需要保藏的菌種和保護(hù)劑按一定的比例放于凍存管中，再將凍存管保藏在超低溫液氮中。常用的保護(hù)劑有甘油、血清蛋白、二甲基亞礬、聚乙烯氮戊環(huán)、糊精、吐溫80等，不同的菌種要根據(jù)自己的特性選擇不同的保護(hù)劑。在超低溫環(huán)境中菌種幾乎喪失了代謝功能，保持了菌株原有的性狀，變異的可能性也大大降低，這種方法對大部分菌株都適用，且保存時間長達(dá)數(shù)年。具體操作方法：把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（ 在塑料瓶的底部放一塊重物，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中），蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細(xì)繩并作記號，以便提出所需的菌種。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫，大約30分鐘后，把安瓿管浸入液氮中進(jìn)行長期保存。啟用液氮罐中保存的菌種時， 應(yīng)先將安瓿管置于35~40℃的溫水中，使瓶內(nèi)的冰塊迅速融解，然后在無菌條件下開啟安瓿管，用接種針取菌塊移接于適宜的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。

4、菌絲分離

挑取健壯菌絲體頂端部分進(jìn)行純化培養(yǎng)，以保持菌種的純度，使菌種恢復(fù)原來的生活力和優(yōu)良種性，達(dá)到復(fù)壯的目的。

5、適當(dāng)更換培養(yǎng)基

長期在同一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菌種，活力可能逐漸下降。在菌種保藏傳代中，經(jīng)常改變培養(yǎng)基成分，或在原有的培養(yǎng)基中添加酵母膏、麥芽汁、氨基酸類物質(zhì)和維生素等，以刺激菌絲生長，提高菌種活力。

6、更新原始宿主菌

工程菌出現(xiàn)菌種退化問題后，技術(shù)人員常用的對策是重新轉(zhuǎn)化保種，誤以為這樣可以解決問題，這種做法對有些退化情況或者短期內(nèi)可能有一定效果，但其實并不能解決問題，類似發(fā)酵異常問題往往還是周而復(fù)始反復(fù)出現(xiàn)。需要明白的是，宿主本身也是菌種，也存在老化退化問題，只有更換原始出發(fā)宿主菌，并更新其相應(yīng)感受態(tài)，然后再轉(zhuǎn)化保種，才有可能頑疾。

三、酵母菌純化復(fù)壯流程舉例

1、菌種活化：將酵母菌種接種在5 % YPD 固體斜面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，重復(fù)2 次。用滅菌牙簽挑取適量活化的酵母菌斑接種于5 mL 液體YPD 培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)12～16 h，此時可達(dá)到對數(shù)生長期。

2、初篩：取上述活化菌液100 μL，置于5 mL PDA 培養(yǎng)基3 種不同的液體培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)12～16 h，分別稀釋為10 萬倍和100 萬倍2 個濃度梯度，取50 μL 稀釋液涂布到相應(yīng)的固體PDA 培養(yǎng)基平皿中，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察并記錄菌落生長情況。

3、復(fù)篩：挑出光滑圓潤、色澤乳白、形狀規(guī)則且較大的菌斑，用牙簽挑取少許置于5 mL PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min 搖培過夜。取1.5 mL 菌液3500 r/min 離心5 min 得菌體，加入1 mL PDA液體培養(yǎng)基重懸，山梨醇、甘油處理過夜。取1 mL 處理后的菌液離心得菌體，分別加入1 mLPDA液體培養(yǎng)基重懸，稀釋10 萬倍后涂布在固體PDA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后觀察記錄。

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