一、背景

兔主動脈平滑肌細胞分離自主動脈組織，是一種常用的細胞模型，用于研究動脈粥樣硬化。它們通常在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使用DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%雙抗。

兔主動脈平滑肌細胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來，兔主動脈平滑肌細胞分離自主動脈組織；主動脈是體循環(huán)的動脈主干。

其運行路徑為：升主動脈起于左心室，至右側(cè)第2胸肋關(guān)節(jié)高度移行為主動脈弓，弓行向左后至第4胸椎體下緣移行為降主動脈；在第12胸椎體高度穿膈的主動脈裂孔移行為腹主動脈，以上為胸主動脈，至第4腰椎體下緣分為左、右髂總動脈；髂總動脈在骶髂關(guān)節(jié)高度分為髂內(nèi)、外動脈。主動脈平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數(shù)細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；

細胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學特征和生長特點。

主動脈平滑肌細胞在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，以主動脈平滑肌細胞為實驗研究對象，探討心血管疾病相關(guān)發(fā)病機制是目前研究的熱點；體外培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞對于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

二、應用

兔主動脈平滑肌細胞可以用于鈣感受器STIM1參與主動脈平滑肌細胞衰老的作用機制研究：

在氧化應激誘導的衰老VSMCs模型及自然衰老的動物模型中,觀察STIM1是否參與主動脈平滑肌細胞衰老進程,及其相關(guān)作用機制。

方法：使用200μM過氧化氫溶液(H2O2)處理人主動脈平滑肌細胞(Human aorta vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs)2h構(gòu)建氧化應激衰老VSMCs模型;C57BL/6分別飼養(yǎng)至3月齡、12月齡、18月齡,建立自然衰老動物模型;Cre-lox P基因重組技術(shù)構(gòu)建平滑肌特異性STIM1敲除小鼠(smc STIM1-/-)模型;采用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色檢測衰老VSMCs陽性率;Western blot檢測細胞或組織中鈣池操縱性鈣通道(store-operated calcium channel,SOC)相關(guān)蛋白STIM1、STIM2、ORAI1表達水平、衰老相關(guān)標記蛋白蛋白p53、p21、p16及自噬相關(guān)蛋白p62、LC3B等表達水平;激光共聚焦測鈣技術(shù)檢測單個細胞的SOCE的鈣信號變化,微血管張力測定技術(shù)檢測收縮劑誘導的及SOC介導的血管收縮功能;轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)檢測STIM1敲除對主動脈平滑肌轉(zhuǎn)錄水平的變化。透視電鏡檢測STIM1敲除對小鼠主動脈平滑肌超微結(jié)構(gòu)的影響;m RFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白系統(tǒng)檢測細胞自噬流變化;流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。

結(jié)果：

(1)在H2O2誘導的衰老VSMCs模型上,衰老相關(guān)蛋白p21、p16表達上調(diào),衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率增加,伴STIM1及ORAI1蛋白表達下調(diào),SOCE水平降低;

(2)老齡小鼠(12月齡、18月齡)主動脈組織SOC相關(guān)蛋白STIM1和ORAI1表達下調(diào),以及SOC通道介導的血管收縮反應下降；

(3)smc STIM1-/-小鼠主動脈組織中STIM1水平下降,而STIM2及ORAI1蛋白表達無明顯差異,SOC介導的收縮反應幾乎消失,不同濃度的Phe誘導的血管收縮無明顯差異,然而在硝苯地平預處理后,有或無細胞外鈣條件下血管收縮幾乎消失;

(4)smc STIM1-/-小鼠主動脈衰老相關(guān)蛋白p53、p21及p16均上調(diào),sh STIM1下調(diào)細胞STIM1表達,并伴隨著衰老相關(guān)蛋白p53、p21及p16表達以及ROS水平的增加;

(5)smc STIM1-/-小鼠主動脈組織轉(zhuǎn)錄組高通量測序顯示下調(diào)基因富集在自噬與線粒體自噬中;

(6)smc STIM1-/-小鼠主動脈組織,超微結(jié)構(gòu)下線粒體腫脹、嵴消失,線粒體面積及長度顯著增加,線粒體分裂相關(guān)蛋白FIS1顯著下調(diào),線粒體融合蛋白MFN2表達上調(diào),自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin表達下調(diào),p62表達上調(diào);

(7)sh STIM1下調(diào)細胞STIM1表達后,自噬相關(guān)蛋白p62、LC3BII表達上調(diào),進一步使用HCQ處理后,sh STIM1+HCQ組LC3BII表達量不高于sh NC+HCQ組。

(8)m RFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白系統(tǒng)檢測,提示氧化應激衰老VSMCs模型自噬小體數(shù)量顯著增多,而自噬溶酶體數(shù)量增加不變;在衰老VSMCs模型中過表達STIM1導致自噬溶酶體數(shù)量顯著增多,并比自噬小體數(shù)量多,HCQ處理可逆轉(zhuǎn)該過程。

(9)過表達STIM1能夠減少衰老VSMCs p21、p16表達以及ROS水平上調(diào),以及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率增加,且HCQ處理后被逆轉(zhuǎn)。

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