通常，研究人員是通過其他人的培訓(xùn)或技術(shù)手冊的描述來掌握RNA提取及分析方法的，因此他們通常不會對實(shí)驗(yàn)流程提出疑問，并且會很快將其作為教條來執(zhí)行。此外，也很難找到記錄有導(dǎo)師和技術(shù)手冊中所教授的“事實(shí)”的文獻(xiàn)。關(guān)于實(shí)驗(yàn)室傳聞，其中有一條是使用DEPC進(jìn)行處理可以使溶液不含RNase。我們對一些傳聞的DEPC處理方法進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，并得到了下文所述結(jié)果。后續(xù)我們還將繼續(xù)推出其他技術(shù)說明，講述測試所發(fā)現(xiàn)的其他RNA“真相”。

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1. 高壓滅菌不能有效清除溶液中的RNase，因?yàn)镽Nase會在溶液冷卻后復(fù)性。

錯誤，因?yàn)閱为?dú)進(jìn)行高壓滅菌確實(shí)可以使大量RNase A失活（圖1）。將不同濃度的RNase A加入到PBS溶液中并進(jìn)行高壓滅菌。之后對每種溶液取用一份與304個堿基的32P標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行混合并在37°C下孵育1小時，然后進(jìn)行凝膠電泳并曝光拍攝。不經(jīng)高壓滅菌處理時，RNase濃度為100 pg/ml時探針開始降解。而高壓滅菌并不能使高至1 ug/ml的RNase A失活，探針在其中嚴(yán)重降解。需注意，高壓滅菌只能使部分RNase失活，不然RNA探針在任意RNase濃度下都會保持完整。單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌對于部分應(yīng)用來說已經(jīng)足以清除足夠的RNase了。但是，因?yàn)橥ǔＮ覀儾磺宄?shí)驗(yàn)對什么樣的RNase污染程度或濃度敏感，所以應(yīng)當(dāng)使用DEPC處理作為額外的預(yù)防措施。另外還需注意，這些實(shí)驗(yàn)僅針對RNase A進(jìn)行了分析，對其他RNase可能不一定準(zhǔn)確。

圖1、高壓滅菌對RNase活性的影響。將不同濃度的RNase A加入到PBS緩沖液中并高壓滅菌25分鐘。每組溶液取1 µl并與1 ng的5 x 10⁴ cpm RNA探針（探針長度為304個堿基）進(jìn)行混合并在37°C下孵育1小時。對反應(yīng)體系取5 µl并用5%的丙烯酰胺/8 M尿素凝膠進(jìn)行分析，然后使用增光屏曝光攝影5小時。

2. 高壓滅菌會使DEPC失活

正確。高壓滅菌會使二乙基焦磷酸鹽水解，從而使DEPC失活，并且期間會釋放出反應(yīng)副產(chǎn)物CO2和乙醇。DEPC在水中的半衰期大約為30分鐘，而對于DEPC濃度為0.1%的溶液，進(jìn)行15分鐘/升的高壓滅菌后即可認(rèn)為其不含DEPC。

3. 對含DEPC的溶液進(jìn)行高壓滅菌應(yīng)當(dāng)足夠久以清除溶液的氣味。

錯誤。高壓滅菌后會殘留輕微的乙醇?xì)馕?，不過更常聞到的是一種甜水果味，這是由副產(chǎn)物乙醇與微量的羧酸殘留結(jié)合并形成揮發(fā)性酯類而造成的。這種氣味并不意味著溶液中仍有DEPC殘留。

4. DEPC處理對多種緩沖液的影響

正確。Tris含有氨基，從而會“吸干”DEPC，使其不能失活RNase（圖2）。分別制備1 M的Tris、MOPS、HEPES和PBS緩沖液，并向每種緩沖液中分別添加0.1%或1%的DEPC。然后向每種溶液中同時加入1 µg/ml的RNase A。對所有緩沖液進(jìn)行高壓滅菌并分別取一份與304堿基長度的32P標(biāo)記RNA探針混合然后在37°C下孵育1小時。然后使用凝膠電泳及曝光攝影來評估探針完整性。Tris和HEPES確實(shí)會使DEPC在0.1%的濃度（大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方案建議濃度）下無法失活RNase。不過，1%的DEPC則足以克服這一影響。當(dāng)使用DEPC處理1 M的MOPS和PBS緩沖液時，兩種濃度（0.1%和1%）下的DEPC仍都可以失活RNase。要預(yù)測DEPC與所有分子生物試劑間的交互作用是不可能的。制備無RNase溶液的最謹(jǐn)慎方案應(yīng)當(dāng)為將分子生物級的粉末狀試劑與DEPC處理水進(jìn)行混合?；蛘?，還可以從賽默飛和其他公司購買預(yù)制的無核酸酶溶液。

圖2、DEPC處理對多種緩沖液的影響。向分別含有0.1%或1%的DEPC緩沖液中加入1 µg/ml的RNase A。對溶液用力振蕩1分鐘，室溫下孵育1小時，然后高壓滅菌25分鐘。對每種緩沖液取1 µl與1 ng 的5 x 10⁴ cpm 304 nt RNA探針混合然后在37°C下孵育1小時。對反應(yīng)體系取5 µl并用5%的丙烯酰胺/8 M尿素凝膠進(jìn)行分析，然后使用增光屏曝光過夜后攝影。

5. 0.1%的DEPC足以抑制溶液中任意量的RNase

錯誤，失活RNase所需的DEPC量會隨著溶液中所含的RNase殘留量的增長而增長（圖3）。分別將100、500和1000 ng/ml的RNase A加入到水中然后使用不同量DEPC進(jìn)行處理。對溶液進(jìn)行高壓滅菌，然后分別取一份與304堿基長度的32P標(biāo)記RNA探針混合然后在37°C下孵育1小時。然后進(jìn)行凝膠電泳和曝光攝影。未處理的溶液或經(jīng)0.01%DEPC處理的溶液可以使100 ng/ml RNase A失活。當(dāng)RNase濃度增加為500 ng/ml時，該DEPC濃度已不足以使RNase失活，探針會發(fā)生降解。將DEPC濃度提高至0.1%時，可以保護(hù)探針免受高至500 ng/ml RNase A的影響，而1%的DEPC則可以使1000 ng/ml RNase A失活。0.1%的DEPC可能對于大多數(shù)來源于周圍環(huán)境或?qū)嶒?yàn)操作（例如使用了大量RNase的核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)及質(zhì)粒制備等）的RNase污染來說都是足夠的。

圖3、不同百分比DEPC對濃度逐漸增加的RNase的影響。向一份水中加入不同濃度的RNase A，用力振蕩1分鐘，室溫下孵育1小時，然后高壓滅菌25分鐘。每種溶液分別取1 µl并與1 ng 的5 x 10⁴ cpm 304 nt RNA探針混合然后在37°C下孵育1小時。對反應(yīng)體系取5 µl并用5%的丙烯酰胺/8 M尿素凝膠進(jìn)行分析，然后使用增光屏曝光過夜后攝影。

6、若0.1% DEPC可以很好地抑制RNase，則1%濃度應(yīng)當(dāng)取得更好的效果

正確，提高DEPC濃度可以抑制更嚴(yán)重的RNase A污染（圖3）。不過，溶液中DEPC殘留或DEPC副產(chǎn)物的高水平殘留會抑制很多酶促反應(yīng)或化學(xué)修飾（羧甲基化）RNA。已有文獻(xiàn)記載了RNA樣品中殘留的DEPC副產(chǎn)物會抑制體外翻譯反應(yīng)的情況（Winkler，未發(fā)表結(jié)果）。在本研究中，我們測試了轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中DEPC作為RNase抑制劑的抑制作用。使用真空離心機(jī)將模板DNA進(jìn)行干燥，然后分別使用0.01%、0.1%和1%的DEPC處理水進(jìn)行重懸。使用32P-UTP，然后添加相同濃度的DEPC水達(dá)到終體積，從而進(jìn)行MAXIscript™的平行雙樣轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。對反應(yīng)體系進(jìn)行孵育并通過TCA沉淀來評估結(jié)合百分比。平均結(jié)合百分比如下：

上述數(shù)據(jù)表明，隨著DEPC量的增加，轉(zhuǎn)錄抑制效果會越嚴(yán)重。再次強(qiáng)調(diào)，0.1%的DEPC大概就足以抑制大多數(shù)RNase，并且對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)帶來的影響小。若懷疑DEPC抑制了反應(yīng)，可使用高質(zhì)量 (MilliQì) 或高壓滅菌水來替代加入反應(yīng)中?？梢允褂肦NaseAlert QC 系統(tǒng) 或參見技術(shù)公告#166《核酸酶及蛋白酶測試：實(shí)驗(yàn)需求及經(jīng)濟(jì)角度考量》對實(shí)驗(yàn)用水進(jìn)行檢測，其中描述了與本研究所用相似的RNase測試方案。

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