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免疫組化(IHC)是一種利用抗體檢測組織切片中蛋白質(zhì)和其他抗原的技術(shù)，通過定位、定性和相對定量來研究這些抗原。以下是恒遠生物為大家總結(jié)的免疫組化實驗的完整攻略。
一、實驗原理
免疫組化基于抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理。組織切片或細胞標本中的抗原先與一抗結(jié)合，然后通過二抗與一抗結(jié)合，最后通過顯色系統(tǒng)(如DAB)或熒光系統(tǒng)使目標抗原可視化。
二、實驗前準備
材料準備：組織切片、抗體、緩沖液等
設(shè)備檢查：確保切片機、孵育箱等設(shè)備正常工作
工作臺清潔：確保無細菌和異物污染
實驗計劃：制定標準化操作流程，合理安排實驗時間
三、詳細操作步驟
1. 樣本處理
組織采集：手術(shù)或活檢獲取組織后，立即用10%中性福爾馬林固定(6-48小時)
脫水包埋：組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后石蠟包埋
切片制備：使用切片機制作4-5微米厚的切片，60°C烤片30-60分鐘
2. 脫蠟水化
二甲苯溶液(Ⅰ)浸泡10分鐘
二甲苯溶液(Ⅱ)浸泡10分鐘
梯度酒精(100%、95%、80%、70%)各浸泡5分鐘
蒸餾水沖洗
3. 抗原修復(fù)
熱修復(fù)：常用pH6.0檸檬酸鹽緩沖液或pH9.0 Tris/EDTA緩沖液，95-100°C加熱20分鐘
酶修復(fù)：使用胰蛋白酶或蛋白酶K處理
冷凍切片可省去或減少抗原修復(fù)步驟
4. 阻斷內(nèi)源性物質(zhì)
3%過氧化氫溶液處理10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶
正常血清(與二抗同源)封閉20分鐘，減少非特異性結(jié)合
5. 一抗孵育
選擇特異性高、親和力強的一抗
用PBS或TBS稀釋一抗(常用比例1:100-1:500)
滴加一抗覆蓋組織，4°C過夜或室溫1-2小時
PBS洗滌3次，每次5分鐘
6. 二抗孵育
選擇與一抗種屬匹配的二抗
室溫孵育30-60分鐘
PBS洗滌3次，每次5分鐘
7. 顯色反應(yīng)
DAB顯色：顯微鏡下控制反應(yīng)時間(通常1-10分鐘)
熒光顯色：避光操作，選擇合適的熒光二抗
8. 復(fù)染與封片
蘇木素復(fù)染細胞核1-2分鐘
梯度酒精脫水，二甲苯透明
中性樹脂封片或使用封片機
四、關(guān)鍵注意事項
樣本質(zhì)量：確保組織新鮮，固定及時充分
抗體選擇：驗證抗體特異性，優(yōu)化稀釋比例
抗原修復(fù)：根據(jù)抗原特性選擇合適方法(pH值、時間)
對照設(shè)置：必須設(shè)置陽性對照和陰性對照
實驗標準化：保持操作條件一致，避免批次差異
試劑保存：抗體分裝保存于-20°C，避免反復(fù)凍融
五、常見問題解決
背景染色高：增加封閉時間，優(yōu)化抗體濃度，延長洗滌時間
無信號：檢查抗原修復(fù)方法，驗證抗體有效性，延長孵育時間
非特異性染色：更換封閉血清，調(diào)整一抗特異性
組織脫落：使用防脫片玻片，優(yōu)化烤片時間和溫度
通過嚴格遵循上述流程和注意事項，可以獲得準確可靠的免疫組化結(jié)果。對于初學(xué)者，建議從標準化試劑盒開始，逐步掌握各項技術(shù)細節(jié)。上海恒遠生物科技有限公司擁有自己的實驗室，備有專業(yè)的技術(shù)研發(fā)團隊，長期致力于各種生物試劑，細胞，血清，ELISA試劑盒的研發(fā)與銷售，實驗提供免費代測服務(wù)，并提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，如果您有實驗上的問題歡迎前來咨詢，為您提供專業(yè)的一對一技術(shù)指導(dǎo)。
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