胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1050

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品說(shuō)明：

ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成α-酮戊二酸，同時(shí)還原NADP+生成NADPH。ICDHc是細(xì)胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來(lái)源，在逆境中該酶活性通常會(huì)發(fā)生顯著變化。

利用ICDHc催化NADP+還原成NADPH反應(yīng)，在340nm下測(cè)定NADPH濃度的增加，即可反映ICDHc活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：用時(shí)加入20mL提取液溶解；

2. 試劑二：用時(shí)每支加275μL雙蒸水充分溶解備用；

3. 試劑三：用時(shí)每支加275μL雙蒸水充分溶解備用；

4. 工作液配制：將試劑一、試劑二、試劑三按85：1：1的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

 所需的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽/勻漿器、 冰和蒸餾水。

測(cè)定步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣本的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。     

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 血清（漿）樣本：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟 

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 按下表步驟加樣：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿/石英96孔板中，加樣本的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在340nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1；迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)2分鐘（酶標(biāo)儀有控溫功能，可以將溫度調(diào)至37℃）；迅速取出比色皿并擦干，記錄2分20秒時(shí)的吸光度A2。計(jì)算ΔA=A2-A1。）

三、ICDHc活力單位的計(jì)算

a、按微量石英比色皿計(jì)算：

1. 血清（漿）ICDHc活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（U/mL）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷V樣本÷T=1608×ΔA

2. 組織中ICDHc活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（U/g質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V提取×V樣本) ÷T=1608×ΔA÷W

3. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞中ICDHc活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（U/10⁴ Cell）=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣本×500)÷T=3.2×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，2×10^-4L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/moL/cm；d：石英比色皿光徑，1cm； V樣本：加入樣本體積，0.01mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；500：細(xì)菌或細(xì)胞密度，500萬(wàn)/mL。

b、按96孔板（UV板）計(jì)算：

將上述公式中光徑d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1. 若A2-A1大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。若初始值A1大于0.5可嘗試將酶液用提取液稀釋。

2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑二、試劑三和樣本在冰上放置，以免變性和失活；工作液37℃水浴放置。

3. 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的 37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

4. 兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。