手機版
化工儀器網(wǎng)手機版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關(guān)注視頻號
聽說沒有，聽說沒有，最近有一款克隆試劑聽上去挺火的呀！
你說的是翌圣一步法快速克?。–at#10923ES）？
對對對，就是它，克隆陽性率高，上至7個連接片段，下至6 μL連接體系，你可以想不到，但它都可以做到！
這么牛嘛，有具體的實驗案例嗎？
那就讓我們一起來看看大家是怎么成功獲得陽性克隆的吧~
單片段典型實驗案例分析
來自同濟大學(xué)A課題組
實驗要點
實驗思路設(shè)計完整。
載體線性化全，載體、片段均純化。
載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應(yīng)時間50℃，10 min。（小翌家的10923ES單片段連接也可快至5 min，歡迎嘗試~）
實驗嚴(yán)謹(jǐn)且驗證充分，菌P、測序均驗證。
實驗亮點
在10 μL小體系下，通過10923ES克隆試劑盒成功構(gòu)建了單基因過表達(dá)載體，陽性率可達(dá)100%。
多片段典型實驗案例分析
來自同濟大學(xué)B課題組
實驗要點
實驗思路設(shè)計完整。
載體線性化全，載體、片段均純化。
載體/片段摩爾比為該實驗者經(jīng)驗累計，由1：2調(diào)整為1：1和1：3。小翌依舊推薦載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應(yīng)時間50℃，30 min。（此為4片段連接標(biāo)準(zhǔn)時間，小翌嚴(yán)選推薦！）
實驗嚴(yán)謹(jǐn)且驗證充分，菌P、測序均驗證。
實驗亮點
4片段+載體連接成功，克隆數(shù)優(yōu)于競品，陽性率100%。片段中包含高GC序列、3×flag標(biāo)簽，片段投入量小于50ng，連接難度較大。
看了以上兩位同學(xué)的實驗結(jié)果，你是否也心癢難耐，想要一展身手！
要想獲得成功的實驗結(jié)果，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炘O(shè)計思路和適合的實驗方法是重中之重。小翌強烈推薦Hieff Clone®系列克隆試劑盒（Cat#10923ES），為您的實驗保駕護航！那么實驗記錄表也是要的，既可以幫助大家記錄實驗細(xì)節(jié)，也能通過記錄表復(fù)盤實驗思路，事半功倍！小翌根據(jù)自己做實驗的經(jīng)驗總結(jié)了實驗記錄本格式，放于文章最后，小伙伴們可自行取用~
載體大小 | bp | 片段大小1、2、3... | bp |
載體酶切位點 | （如果為反向PCR，可不填） | 片段含同源臂的引物序列 | |
可通過翌圣無縫克隆引物設(shè)計軟件 進行引物設(shè)計 | |||
線性化載體純化方式 | 片段純化方式 | ||
載體濃度 | ng/μL | 片段濃度 | ng/μL |
載體投入體積 | μL | 片段投入體積 | μL |
推薦翌圣—支持中心—生物計算器—克隆連接投入量計算板塊，輸入片段數(shù)、濃度、大小，即可獲得投入量： | |||
反應(yīng)條件 | 溫度 ℃、時間 min | ||
感受態(tài)轉(zhuǎn)化步驟 | 如：小翌的快速感受態(tài)細(xì)胞 1、提前15 min將LB平板放到37℃培養(yǎng)基中預(yù)熱。 2、將F-DH5α感受態(tài)細(xì)胞（DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）從-80℃拿出迅速插入冰上，待菌體融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物），輕輕彈勻，冰浴靜置5 min。 3、用200 μL移液槍將上一步的混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，均勻涂布。 4、將平板置于37℃培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)。若進行藍(lán)白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養(yǎng)15 h。 | ||
挑單菌落 | 用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至新一代快速菌落PCR Mix中混勻（2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接進行PCR反應(yīng)。共計挑 個單菌落，陽性率 （陽性條帶數(shù)/單菌落個數(shù)）。 | ||
測序 | （推薦使用一條載體通用測序引物+目的片段另一端引物送去測序驗證） | ||
明星產(chǎn)品推薦
克隆實驗流程 | 產(chǎn)品定位 | 名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
載體、片段制備 | 高保真PCR | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
同源重組 | 1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
轉(zhuǎn)化 | 5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 | F DH5α化學(xué)感受態(tài) | 11803ES80 | 10×100 μL |
菌落PCR | 快速PCR升級，可菌P且適用復(fù)雜模板擴增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 10167ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
目的片段保存、測序 | TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購中心