【原因1】光毒性對細胞造成了損傷

熒光觀察時，激發(fā)光的波長越短或光照越強，對細胞造成的損傷也就越大。這就是所謂的“光毒性^*1”，不僅會導(dǎo)致細胞因受損而衰弱、死亡，還有可能會造成出乎意料的影響。

1. *1：光毒性：通常指照射的光造成的損傷，但是在熒光觀察時，指細胞產(chǎn)生的活性氧使周圍的細胞遭受損傷。

2. *2：增益：對相機接收的信號進行放大。放大程度越高（調(diào)高增益），顯示的畫面越明亮。雖然像素數(shù)不會變，但是會產(chǎn)生噪點。

3. *3：Binning：虛擬地結(jié)合周圍的像素，放大單位像素接收的光信號的功能。噪點較調(diào)高增益時更少，但是像素數(shù)會減少。

【原因2】沒有穩(wěn)定供給合適的環(huán)境

多數(shù)細胞都喜歡與生物體內(nèi)相同的環(huán)境。以人類細胞為例，在培養(yǎng)室及培養(yǎng)用恒溫箱中，基本上都需要滿足溫度37℃、二氧化碳濃度5%、濕度95%以上的條件。如果沒有穩(wěn)定供給這一條件，細胞就會衰弱，很難獲得準確數(shù)據(jù)。

【原因3】菌、污染造成的影響

有的細胞容易受容器上附著的菌、污染物的影響。此外，移液管等實驗用器械可能也會導(dǎo)致支原體污染^*4、交叉培養(yǎng)污染 ^*5。

【原因1】溫度漂移^*7導(dǎo)致細胞移動，設(shè)定出錯

如果在接通裝置電源后馬上進行拍攝設(shè)定，焦點在設(shè)定期間可能就會發(fā)生偏移。這是因為接通電源后的一段時間內(nèi)，容器內(nèi)的培養(yǎng)液會發(fā)生對流，細胞也會移動。觀察設(shè)備等也會因溫度變化而出現(xiàn)一定的膨脹現(xiàn)象，使焦點發(fā)生偏移。在觀察漂浮細胞、粘附細胞時，都需要注意拍攝設(shè)定中與拍攝中的溫度偏差。

【原因2】分裂時細胞運動

活著的細胞在分裂時尤其會朝上下方向（Z方向）運動。因此，如果在分裂的瞬間用高倍率進行單次自動對焦拍攝，焦點會發(fā)生偏移。

1. *8：景深：表示對焦的范圍。一般NA越高景深越淺。

2. *9：Z棧的設(shè)定范圍：Z棧是對不同的Z位置數(shù)據(jù)進行多張拍攝的功能。拍攝范圍越大移動步徑越小，可獲得的信息越多，但是細胞的損傷也相應(yīng)地增加，因此希望以盡可能少的張數(shù)進行設(shè)定。

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【原因】細胞動了

實驗時間越長，細胞逃離視野范圍的可能性越高。只要細胞是活著的，就無法避免這一問題。相信大家都在各類論文中讀到過觀察細胞細節(jié)的數(shù)據(jù)。其中的絕大多數(shù)，都是通過高倍率反復(fù)進行多次拍攝后獲得的結(jié)果，需要耗費大量的時間和精力。

要切實避免失敗，較好的方法就是一次性拍攝多點，或者是讓視野追隨移動的細胞進行拍攝。

1. *10：曝光時間和圖像抖動：調(diào)弱激發(fā)光，曝光時間自然變長。如果在打開快門期間細胞動了，圖像就會抖動。要防止這種現(xiàn)象，使用高靈敏度的相機是一種有效的辦法。

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