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慢病毒包裝詳細(xì)過程

來源:上海喆圖科學(xué)儀器有限公司   2024年03月14日 17:16  

一、實驗準(zhǔn)備

1、健康的HEK 293T細(xì)胞,一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的生產(chǎn),要求無細(xì)菌、真菌以及支原體污染;

2、轉(zhuǎn)染試劑,如PEI、Higene、lipo2000lipo3000

各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別,小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑。

3、DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(10%FBS1%P/S);

4、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理)

5、0.45μm的細(xì)菌濾器。

二、包裝步驟

Day1

7:00 PM)鋪板HEK 293T細(xì)胞

數(shù)量:400/10 cm dish ;覺得計數(shù)麻煩的話,可以在293T細(xì)胞長到約90%匯合時,1:5傳代(均分成5份),每1份的數(shù)目差不多就是400萬了。

Day2

3:00 PM)三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在培養(yǎng)箱中恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)約20h,此時可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體系三種質(zhì)粒的配比有許多種方式,目前MDL使用4:3:1的比例,即PxpAx2PMD2gPLVX(載有你基因的質(zhì)粒)。10cm dish一般轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量為20μgPEI的量為質(zhì)粒的2.5-3倍(也就是50μg-60μg,一般推薦按照2.5倍來)。按照比例算下來,PxpAx2PMD2gPLVX的質(zhì)量比為:(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意:在提到質(zhì)粒的量時,千萬記得說質(zhì)量而不是濃度,不然容易出錯。

實驗步驟:

取如上總質(zhì)量為20μg的質(zhì)粒添加到總體積500μLDMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為A液,移液槍混勻20次;

PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg(也就是50-60μL)添加到總體積500μLDMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為B液,移液槍混勻20次;

B液逐滴滴加到A液中,移液槍輕柔混勻66次,室溫靜置15-20min;

將靜置好的轉(zhuǎn)染試劑(A+B)緩緩滴加到恢復(fù)狀態(tài)20hHEK 293T細(xì)胞中。

做好標(biāo)記,記好轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、換液時間等參數(shù)提高實驗重復(fù)性。

Day3

9:00 AM)換液

轉(zhuǎn)染后的第18h,將含有轉(zhuǎn)染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養(yǎng)基;對于新手,為了防止在換液時將細(xì)胞吹散,可以留3mL的液體在dish中,更換8mL DMEM培養(yǎng)基。

Day4

3:00 PM)收集病毒液

在轉(zhuǎn)染后的48-72h,為病毒生產(chǎn)的高峰期,一般我們收集轉(zhuǎn)染后48h(換液后30h,產(chǎn)毒30h)的病毒液用于實驗,足以滿足大部分實驗需求。收集病毒于15mL tube中,500g5mL離心去細(xì)胞碎片和雜質(zhì),隨后使用注射器和濾器進(jìn)行過濾。收集后的病毒上清可以用來進(jìn)行感染和儲存。

三、慢病毒滴度測定

病毒滴度的單位為:TU/mL,代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的病毒顆粒的數(shù)目。

計算公式為:滴度=(感染時細(xì)胞數(shù)(個)*陽性細(xì)胞%/病毒液體積(mL

病毒液體積和感染時細(xì)胞數(shù)已知,需通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)陽性細(xì)胞百分比。

滴度測定常常使用HEK 293T細(xì)胞,大致的原理為,將在DAY3收集到的病毒上清,按照梯度添加到293T細(xì)胞中,感染后48h檢測陽性細(xì)胞的比例,從而確定病毒的滴度。

四、注意事項

293T細(xì)胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi),最多不超過20代,否則影響轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍,純度260/2801.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高。混合體輕輕滴入細(xì)胞上清后搖勻,動作要輕,293T細(xì)胞貼壁不牢避免細(xì)胞脫落。





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