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T4 DNA連接酶可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA中毗鄰的5’磷酸基團和3’ 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵。酶還可以修復雙鏈DNA，RNA或DNA/RNA復合體中的單鏈切口，連接DNA的粘性和平末端，但是該酶對單鏈核酸無酶活性。
T4 DNA連接酶的作用過程可以分為3個步驟：
1、連接酶的賴氨酸活性位點對ATP的α-磷酸基團親核攻擊，釋放PPi，并生成T4 DNA連接酶-AMP中間體。
2、DNA鏈的5' -磷酸基團攻擊連接酶-AMP中間體，AMP被轉移到DNA鏈的5' -磷酸基團上，生成DNA-腺苷酸中間體。
3、DNA鏈的3' -羥基進攻5' -磷酸基團，形成磷酸二酯鍵，釋放AMP。
使用注意事項：
1、使用前應在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。
2、T4 DNA Ligase對熱敏感，容易失活。使用時請放置冰上，用后立即置冰箱中冷凍保存。
3、如需在接反應后滅活T4 DNA Ligase，可于65℃孵育10min即可。
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