聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①模板核酸的制備；②引物的質(zhì)量與特異性；③酶的質(zhì)量；④PCR條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析檢測。

1、 模板

a．模板質(zhì)量不佳，含有雜蛋白質(zhì)，特別是染色體中的組蛋白；模板核酸變性不夠；提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。建議選擇質(zhì)量可靠的提取試劑，重新提取高純度基因組模板；若模板為cDNA，需要檢查逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及其所用RNA的純度及完整度。

b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性，或含有Taq酶抑制劑。

c．模板濃度過高，或含有一些buffer，抑制PCR擴(kuò)增，如cDNA模板，建議稀釋后再使用。

d．靶序列變異。如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，導(dǎo)致PCR不能有效擴(kuò)增。

2、引物：引物的設(shè)計(jì)、引物質(zhì)量是PCR擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵。

a．引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠、引物之間形成二聚體等，需要重新設(shè)計(jì)引物。

b．合成高質(zhì)量、高純度級別的引物。

c．引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期4℃保存，導(dǎo)致引物降解失效。

3、  酶的質(zhì)量：

a．酶失活，建議更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或活性降低而導(dǎo)致沒有產(chǎn)物。

b．酶擴(kuò)增效率低，建議更換擴(kuò)增效率高的酶。

4、 PCR條件:

a．PCR擴(kuò)增條件：變性對PCR擴(kuò)增相當(dāng)重要，如變性溫度低、變性時間短都有可能出現(xiàn)擴(kuò)增無產(chǎn)物；退火溫度過低，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。

b．Mg2+濃度：Mg2+濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高會降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗。

c．反應(yīng)體系：反應(yīng)體系配制錯誤，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通常進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)采用的是小體系，正式實(shí)驗(yàn)如需擴(kuò)大體系時，一定要重新摸索條件，否則容易出現(xiàn)擴(kuò)增效果不理想或者失敗。