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一、引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。dna合成儀有很多種,主要都是由abi/pe公司生產(chǎn)，無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。
二、主要為abi3900高通量合成儀，合成長鏈主要采用beckman1000m和pe8909dna合成儀，引物修飾和高od數(shù)合成采用abi394等。亞磷酰胺三酯法合成dna片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將dna固定在固相載體上完成dna鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。第一步是將預(yù)先連接在固相載體cpg上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯YI酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)dmt。
三、PCR是為測(cè)序富集模板DNA的一種相對(duì)簡(jiǎn)單的方法。為保證DNA序列準(zhǔn)確性，強(qiáng)烈建議使用高保真PCR來制備測(cè)序模板。在Sanger測(cè)序中，PCR擴(kuò)增片段經(jīng)純化并用于測(cè)序反應(yīng)。使用常用的測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)(如M13或T7“通用引物”結(jié)合位點(diǎn))對(duì)PCR引物的5′末端進(jìn)行標(biāo)記，以簡(jiǎn)化測(cè)序工作流程。
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