實(shí)驗(yàn)原理：  

重組子的建立：采用雙酶切 質(zhì)粒 載體pBR322和pUC18,酶切后產(chǎn)生了互補(bǔ)的粘性末端,在T4 DNA 連接酶的作用下,兩個(gè)質(zhì)粒片段連接.

感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells)：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化學(xué)試劑法)的處理后, 細(xì)胞膜 的通透性發(fā)生變化,成為能容許多有外源DNA的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞(competent cell) .

轉(zhuǎn)化(transformation)：是將異源DNA分子引入一 細(xì)胞株 系,使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù).

電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞,通過(guò)高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞.

克隆的篩選：主要用不同 抗生素 基因篩選.常用的 抗生素 有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；

重組質(zhì)?？寺〉蔫b定：鑒定帶有重組質(zhì)粒克隆的方法常用的有α-互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法.

方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析,對(duì)于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合α-互補(bǔ)現(xiàn)象來(lái)篩選.

操作方法：  

1、構(gòu)建重組質(zhì)粒

質(zhì)粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切,將酶切產(chǎn)物按照1：1的比例混合,使用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒.

2、制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞

收集大腸桿菌細(xì)胞,采用CaCl2處理,制備成 感受態(tài)細(xì)胞 .

3、重組子的轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒加入到制備的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液中,電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中.

4、重組子的篩選鑒定

采用藍(lán)白篩選重組子.酚/氯/仿快速抽提質(zhì)粒,酶切后 電泳 鑒定.


步驟與注意事項(xiàng)：

1、連接反應(yīng)溫度選擇要適中,過(guò)高粘末端之間形成氫鍵不穩(wěn)定,過(guò)低會(huì)影響 連接酶 的活性.

2、連接反應(yīng)兩種質(zhì)粒的比例為1：1,否則容易自連.

3、制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)要采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期的細(xì)胞,低溫處理時(shí)間要足夠.

4、電擊法時(shí)電擊電壓、電流、時(shí)間選擇要合適.

5、轉(zhuǎn)化及藍(lán)白篩選要作陰、陽(yáng)性對(duì)照,防止出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性.