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 冰凍切片NADH心肌黃酶（NADH-TR）活性染色試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 冰凍切片NADH心肌黃酶（NADH-TR）活性染色試劑是一種旨在使用人工電子受體染料硝基藍(lán)四氮唑（NBT），受到NADH心肌黃酶催化還原，產(chǎn)生不溶性紫藍(lán)色色素沉淀，來分析冰凍組織樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良傳統(tǒng)方法、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于動(dòng)物肌肉組織細(xì)胞的心肌黃酶活性定性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

心肌黃酶（Diaphorase），又稱為硫辛酰胺脫氫酶（lipoamide dehydrogenase），黃遞酶，二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氫硫辛酸脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期從豬心肌中提取，產(chǎn)品又呈現(xiàn)熒光的黃綠色蛋白質(zhì)，故被稱為心肌黃酶。分子量102000至110000。NADH心肌黃酶直接和黃素蛋白（Flavoprotein）反應(yīng)，釋放出氫原子，將氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）還原為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），傳遞氫原子給氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作為電子供體，還原人工電子受體，例如染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍(lán)四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），產(chǎn)生不溶性甲暨色素，由此用于鑒別動(dòng)物肌肉組織類型。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）           毫升

 染色液（Reagent B）           毫升

 反應(yīng)液（Reagent C）           毫升

 透亮液A（Reagent D）          毫升

 透亮液B（Reagent E）          毫升

 透亮液C（Reagent F）          毫升

產(chǎn)品說明書              1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）和 反應(yīng)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里； 透亮液（Reagent D）具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

中性樹脂：用于切片封片

光學(xué)顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

實(shí)驗(yàn)步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取xx微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為 染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

1． 取出待測(cè)的10微米厚的冰凍組織切片 

2． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個(gè)樣品表面

3． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

4． 小心加上xx微升  染色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照

6． 小心移去切片上的 染色工作液

7． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

8． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

9． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟6至8二次

10． 小心加上xx微升 透亮液A（Reagent D）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

11． 室溫下孵育5分鐘（注意：根據(jù)退色程度，調(diào)整孵育時(shí)間）

12． 小心移去切片上的 透亮液A（Reagent D）

13． 小心加上xx微升 透亮液B（Reagent E）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

14． 室溫下孵育5分鐘（注意：根據(jù)退色程度，調(diào)整孵育時(shí)間）

15． 小心移去切片上的 透亮液B（Reagent E）

16． 小心加上xx微升 透亮液C（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

17． 室溫下孵育5分鐘（注意：根據(jù)退色程度，調(diào)整孵育時(shí)間）

18． 小心移去切片上的 透亮液C（Reagent F）

19． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

20． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

21． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟19至20二次

22． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）

23． 即刻在光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)：

表達(dá)NADH心肌黃酶的組織細(xì)胞為陽性組織細(xì)胞

呈現(xiàn)深紫藍(lán)色為I型肌纖維

淺紫藍(lán)色為II型肌纖維

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3．  反應(yīng)液（Reagent C）避免反復(fù)凍融

4． 陰性對(duì)照時(shí)， 染色工作液不含有 反應(yīng)液（Reagent C）

5． 心肌組織可以用于陽性對(duì)照

6． 每次更換試劑溶液時(shí)，保持切片面基本晾干

7． 試劑溶液在切片表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿切片表面

8． 整個(gè)操作，在避光狀態(tài)下進(jìn)行

9． 染色孵育時(shí)間，根據(jù)樣品和酶活性強(qiáng)弱調(diào)整，通常為5至60分鐘

10． 使用 透亮液A、B、C時(shí)，注意觀察去色變化，切莫過度退色

11． 透明+封片處理后，可以強(qiáng)化染色

12． 染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察

13． 樣品染色后保存，避免光照

14． 染色參考圖像見下圖

15． 本公司提供系列組織細(xì)胞酶活性染色試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰