細(xì)胞鉀離子（potassium ion）濃度熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  細(xì)胞鉀離子（potassium ion）濃度熒光定量檢測(cè)試劑盒是一種旨在通過(guò)鉀離子敏感性熒光探針PBFI，與鉀離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下觀察相對(duì)熒光峰值的變化，來(lái)測(cè)定樣品中總鉀離子濃度的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物和人體細(xì)胞裂解懸液樣品中總鉀離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

鉀離子（potassium ion；K）是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，尤其是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)中的重要陽(yáng)離子。其功能在于維持細(xì)胞內(nèi)外的酸堿平衡、滲透壓、膜電位、神經(jīng)肌肉功能等。血鉀增高，即高血鉀癥（hyperkalemia）與腎衰、脫水性休克、腎上腺皮質(zhì)功能不全有關(guān)；而血鉀降低，即低鉀血癥（hypokalemia）與營(yíng)養(yǎng)不良、負(fù)氮平衡、胃腸道液體流失等有關(guān)。正常人體的血鉀濃度范圍狹窄，在3至6毫摩爾。鉀的檢測(cè)包括化學(xué)沉淀法、離子選擇性電位分析法（ion selective potentiometry；ISP）、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到其它金屬元素的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。鉀結(jié)合性苯并呋喃間苯二甲酸（potassium binding benzofuran isophthalate；PBFI），是苯并呋喃間苯二甲酸衍生物，其熒光基團(tuán)與重氮冠醚（diazocrown ether）的氮分子鏈接，產(chǎn)生相應(yīng)配體的選擇性，一旦與鉀離子結(jié)合，其熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，可以敏感測(cè)定游離鉀離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長(zhǎng)340至380nm，散發(fā)波長(zhǎng)450至550nm，來(lái)定量測(cè)定的鉀離子濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）            毫升

  裂解液（Reagent B）            毫升

  反應(yīng)液（Reagent C）            毫升

  飽和液（Reagent D）            毫升

  陰性液（Reagent E）            毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；  反應(yīng)液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

黑色96孔板：用于樣品熒光測(cè)定的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于樣品熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx  清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx  裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，例如細(xì)胞裂解懸液等，置于冰槽里備用

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（25℃）：激發(fā)波長(zhǎng)345nm，散發(fā)波長(zhǎng)510nm

三、熒光測(cè)定

1． 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板，標(biāo)記為：樣品孔、空白對(duì)照孔、最大對(duì)照空

2． 移取100微升（20微克蛋白）樣品到樣品孔里

3． 移取xx  飽和液（Reagent D）到最大對(duì)照空里

4． 移取xx  陰性液（Reagent E）到空白對(duì)照空

5． 分別加入xx  反應(yīng)液（Reagent C）到所有孔里

6． 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板，混勻

7． 室溫下（25℃），孵育30分鐘，避免光照

8． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 

9． 計(jì)算樣品鉀離子濃度（注意：不要遺忘乘上稀釋倍數(shù)）

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定

4． 用戶可以選擇激發(fā)波長(zhǎng)340至380nm，散發(fā)波長(zhǎng)450至550nm的任一波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)

5． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

6． 樣品濃度可以按照細(xì)胞數(shù)或蛋白量定義

7． 本公司提供系列鉀生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感