冰凍切片組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位熒光染色檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  冰凍切片組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位熒光染色檢測試劑是一種旨在通過熒光染料甲酚紫標記的多肽底物作為探針，自由進入細胞內(nèi)，受到組織蛋白酶B水解后，呈現(xiàn)熒光現(xiàn)象，以分析樣品酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種冰凍組織內(nèi)組織蛋白酶B的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細胞器內(nèi)，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細胞內(nèi)蛋白和細胞外蛋白通過內(nèi)吞進行周轉(zhuǎn)中起著重要作用，同時也是啟動和傳遞細胞凋亡信號的替代機制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱為CTSB，作為溶酶體的標志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白斑點（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉(zhuǎn)移、骨再吸收、細胞內(nèi)或分泌性調(diào)節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)、卵細胞成熟、細胞凋亡等方面具有重要作用。細胞間接觸和細胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉(zhuǎn)化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結(jié)締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應(yīng)。組織蛋白酶B異常，將導(dǎo)致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。使用熒光標記的特異性底物可以探測組織蛋白酶B的特異活性。熒光染料甲酚紫（cresyl violet）上基團，通過酰胺（amide linkage）與人工合成的二肽化合物組織蛋白酶B底物RR（Arg-Arg；精氨酰精氨酰）雙重替換后，受到組織蛋白酶B的水解后，釋放出具有紅色熒光的單一基團替換或無替換的甲酚紫，以此進行熒光（激發(fā)波長510至560nm，散發(fā)波長570至620nm波長）檢測組織蛋白酶B的活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

  染色液（Reagent A）            微升

  稀釋液（Reagent B）            毫升

  清理液（Reagent C）            毫升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存  染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；  染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細胞熒光定性分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent B）室溫下預(yù)熱。然后移出xx微升  染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  稀釋液（Reagent B），混勻后，室溫下靜置，并標記為  染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

1． 準備2片待測的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片（注意：建議使用異戊烷快速冷凍制片）

2． 置于室溫下，小心加上xx微升預(yù)冷的  清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面

3． 小心移去切片上的  清理液（Reagent C）

4． 小心加上xx微升室溫預(yù)熱的含有  染色液（Reagent A） 和  稀釋液（Reagent B）的  染色工作液，鋪滿整個切片表面

5． 在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育30至60分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)；可以蓋上蓋玻片孵育）

6． 小心移去切片上的  染色工作液，避免光照

7． 小心加上xx微升  清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面

8． 小心移去切片上的  清理液（Reagent C）

9． 放上蓋玻片或封片

10． 即刻在共聚焦或倒置熒光顯微鏡下進行觀察 ：濾波器激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長610nm ――如果紅色熒光強度顯著增強，表明組織蛋白酶B活性增強

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（0.1毫升工作液）操作

2． 所有操作均須無菌狀態(tài)下進行

3． 操作時，須戴手套

4． 建議使用正常組織切片作為陰性對照，顯示微弱的背景信號

5． 建議染色完成后，即刻進行熒光檢測分析

6． 用戶可以使用510至560nm激發(fā)波長和570至620nm散發(fā)波長的任一波長進行檢測

7． 用戶可以使用赫斯特33342（Hoechst33342）進行復(fù)染，終濃度為1微克/毫升

8． 孵育時，必須避免光照

9． 本公司提供系列組織蛋白酶熒光染色分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰