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熒光定量PCR反應(yīng)就是從RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA，然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA的過程。Super一步法RT-PCR(AMV)試劑盒采用了一步反應(yīng)法完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng)，即RNA-cDNA-PCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中不需增加額外的步驟，就可完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng)，同時(shí)整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)且含有電泳時(shí)所需要的試劑，可直接上樣電泳。本試劑盒具有方便、簡(jiǎn)捷、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可適用于各種動(dòng)、植物、病毒RNA的PCR檢測(cè)。
熒光定量PCR使用注意事項(xiàng)：
1.平臺(tái)效應(yīng)：PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。
2.防止DNA的污染：①采用DNA酶處理RNA樣品；②在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。
3.RNA提取試劑盒：目前試劑公司有多種RNA提取試劑盒、cDNA試劑盒、PCR試劑盒以及RT-PCR試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。如果使用試劑盒，具體操作步驟請(qǐng)參照試劑盒說明書。
熒光定量PCR的使用方法和用途：
1.支原體常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒(一步法)
1)適合科研單位檢測(cè)，或單位內(nèi)檢，用PCR法檢測(cè)細(xì)胞或其他生物基質(zhì)。
2) 比藥典操作標(biāo)準(zhǔn)合并了一步，(將內(nèi)控對(duì)照試劑預(yù)先混合在PCR mix試劑中)，操作更簡(jiǎn)潔。
3)樣本量為2μl，靈敏度為20個(gè)基因組拷貝/反應(yīng)。結(jié)果準(zhǔn)確。
2.支原體常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒(經(jīng)典法，不含Taq酶)
1) 符合歐洲藥典、中國藥典要求，更適合細(xì)胞治療，CAR-T，抗體藥、疫苗等臨床項(xiàng)目申報(bào)和質(zhì)檢。
2)樣本需先做DNA抽提。抽提后樣本加入量為10μl。
3)試劑盒中不含Taq酶，需另外購買。
4) 廠家可協(xié)助完善方法驗(yàn)證步驟。
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