手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號(hào)：chem17
掃碼關(guān)注視頻號(hào)
蛋白質(zhì)表達(dá)、分離、純化可以：
(1)探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理；
(2)供作結(jié)構(gòu)與功能的研究；
(3)作為催化劑、營(yíng)養(yǎng)劑等。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一：材料準(zhǔn)備
1. 實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌 BL21、LB 液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸餾水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉
2. 實(shí)驗(yàn)儀器：搖床、離心機(jī)、層析柱、離心管、移液槍、槍頭盒、燒杯、玻璃棒
二：實(shí)驗(yàn)操作
1. 試劑準(zhǔn)備
2. 獲得目的基因
① PCR 方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn))，PCR 循環(huán)獲得所需基因片段。
② 通過(guò) RT-PCR 方法：用 TRIzol 法從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，以 mRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成 cDNA 第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行 PCR 循環(huán)獲得產(chǎn)物。
3. 構(gòu)建重組表達(dá)載體
?、?載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收 Kit 或凍融法回收載體大片段。
?、?PCR 產(chǎn)物雙酶切后回收，在 T4DNA 連接酶作用下連接入載體。
4. 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
① 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗 Amp 或藍(lán)白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
?、?測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確， 進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
?、?以此重組質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
5. 氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)
?、?接種含有重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液體培養(yǎng)基中(含 100 ug/mL 氨芐青霉素)，37 ℃ 震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
?、?按 1∶50 或 1：100 的比例稀釋過(guò)夜菌，一般轉(zhuǎn)接 1 mL 過(guò)夜培養(yǎng)物于 100 mL(含 100 ug/mL 氨芐青霉素)LB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 震蕩培養(yǎng)至 OD600 = 0.6 - 0.8(最好 0.6，大約需 3 h)。取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
?、?對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)組加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/l，37℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 1-3 h。
?、?12 000 rpm 離心 10 min，棄上清，菌體沉淀保存于 -20 ℃ 或 -70 ℃ 冰箱中。
6. 氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化
① NTA 層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入 1 mL NTA 介質(zhì)，并分別用 8 mL 去離子水，8 mL 上樣緩沖液洗滌。
② 重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入 5 mL 上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品 60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。取 10 ul 上清樣品用于 SDS-PAGE 分析。
?、?上清樣品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
④ 洗脫雜蛋白：用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱，直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脫液，約 3-4 h，取 10 ul 洗脫開(kāi)始時(shí)的樣品用于 SDS-PAGE 分析。
?、?洗脫目標(biāo)蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 級(jí)分，分別取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類(lèi)作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí)，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購(gòu)中心